•  

Резюме

Въведение

Някои специфични мозъчни области остават „пластични“ в зряла възраст, което означава, че те могат да бъдат подложени на функционално или морфологично преустройство. Хипоталамусът, който осигурява координация както на ендокринните, така и на вегетативните функции, и по този начин дългосрочна стабилност на вътрешната среда, също може да се подложи на ремоделиране. Доказано е, че широк набор от състояния предизвикват хипоталамусна пластичност, включително външни сензорни стимулации като вариации в фотопериода или околната температура, както и индивидуални физиологични колебания, като например по време на дехидратация, лактация и яйчников цикъл (Oliet, 2002; Prevot, 2002; Ebling и Barrett, 2008). В допълнение, хипоталамусната пластичност изглежда широко запазен процес, срещан при жаби, птици, гризачи и примати.

адаптирането

Участието на хипоталамусната пластичност в контрола на енергийната хомеостаза на цялото тяло се появи като нова концепция през 2004 г. (Pinto et al., 2004). Този процес изглежда от съществено значение и неговото увреждане може да допринесе за затлъстяването. При лабораторни животни бързото пренареждане на хипоталамуса може да бъде постигнато чрез използване на различни експериментални процедури, включително гладуване и хормонално лечение с екзогенни хормони като лептин и грелин (Pinto et al., 2004; Sternson et al., 2005; Andrews et al., 2008; Yang et al., 2011). Такива манипулации предизвикват значителни промени в поведението на храненето, които вероятно се предизвикват, поне отчасти, от стимулираната хормонално-зависима реорганизация на синапсите в специфични хипоталамусни неврони (Pinto et al., 2004; Sternson et al., 2005; Andrews et al ., 2008; Yang et al., 2011). Независимо от това дали хипоталамусната пластичност може да играе роля в регулирането на приема на храна при наивни животни според промените в техните хранителни условия, все още не е известно. За да се справим с този проблем, изследвахме пластичността на хипоталамуса при възрастни мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в продължение на 1 седмица.

Материали и методи

Животни.

Протоколите, които включват манипулиране на животни, бяха прегледани от местния етичен съвет и бяха в строго съответствие с насоките на Европейската общност (директива 86/906). Проведени са експерименти с 2-месечни мъжки мишки C57BL/6JOla от лаборатории Harlan. Мишките бяха настанени поотделно и хранени със стандартна гранулирана търговска чау-диета (A04; Safe) в продължение на 1 седмица след пристигането. След аклиматизацията те бяха хранени или със същата стандартна диета (STD), или с персонализирана силно вкусна диета с високо съдържание на мазнини (Safe). Характеристиките на диетите са дадени в таблица 1. Промяната в диетата е направена в 9:00 ч. Сутринта. и както стандартната, така и диетата с високо съдържание на мазнини се подновяваха всеки ден в 9:00 ч. Мишките имат свободен достъп до храна и вода. Консумацията на храна и телесното тегло (BW) се измерват ежедневно. За метаболитни изследвания чрез индиректна калориметрия, мишките са настанени в отделни херметични клетки и газообменът е наблюдаван с помощта на система за въздушен анализатор (Oxylet; BIOSEB). За събиране на тъкани мишките бяха убити между 9:30 ч. Сутринта. и 12:00 ч. Някои експерименти използват 8- до 10-седмични мъжки трансгенни хомозиготни нокаутирани PST-1 мишки. Тези мишки са генерирани чрез използване на целеви мутации в гена ST8SiaIV (Eckhardt et al., 2000).

Характеристики на диетите, показващи енергийния състав, центезималния състав и биохимичния анализ на липидното съдържание

Двустранно инжектиране в хипоталамуса.
Дисекция на хипоталамус за анализ на qPCR.
Извличане и обработка на РНК.

Тъканите бяха лизирани и хомогенизирани в 300 μl лизисен буфер (RLT буфер, Qiagen), използвайки системата TissueLyser (Qiagen) и 5 ​​mm топчета от неръждаема стомана (Qiagen). Общата РНК беше изолирана върху въртящи се колони с мембрани на основата на силициев диоксид (RNeasy Mini Kit, Qiagen), следвайки инструкциите на производителя. ДНК разграждането се извършва директно върху колоните. РНК се елуира с 30 μl Н20. Аликвотни части от всеки екстракт (1 μl) бяха проверени за концентрация на РНК, чистота и цялост с помощта на системата за електрофореза Experion (Bio-Rad) и набора за анализ на Experion RNA StdSens (Bio-Rad). След това общите РНК се съхраняват при -80 ° C. Малко количество пречистени РНК (0.2 μg) бяха обратно транскрибирани в 20 μl смес, като се използва сДНК архивен комплект с голям капацитет (Qiagen), както е посочено от производителя. След това синтезираната cDNA се съхранява при -20 ° C.

qPCR анализ от TaqMan масив с ниска плътност.
Имунохистохимия.

Мишките се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на смес от кетамин/ксилазин и след това се перфузират интракардиално с 4% разтвор на параформалдехид. Мозъците бяха премахнати, фиксирани при 4 ° C за една нощ, криозащитени с 30% захароза за 2 d при 4 ° C, замразени в изопентан при -60 ° C и накрая съхранявани при -80 ° C до употреба. Хипоталамусът беше нарязан на 30 μm серийни секции с криостат (Leica). Пет секции от събраните 15–18 секции, съдържащи дъговидното ядро, бяха третирани за имунохистохимия. Първоначално секциите бяха блокирани за 3-4 часа и след това инкубирани за една нощ при 4 ° С с анти-PSA (молекула на полизална киселина) антитяло (1: 6000, # AbC0019, EuroBio). След измиване срезовете след това се инкубират в конюгиран с Alexa546 кози антимиши IgM (Invitrogen, 1: 400) в продължение на 2 часа при стайна температура. След по-нататъшно измиване, секциите най-накрая бяха задържани с монтажна среда и покриващо покритие.

Придобиване и анализ на изображения.

За денситометричен анализ, имуномаркираните срезове бяха разгледани на конфокален микроскоп (Leica SP2) под 40 × маслено потапяне. Изображения на имунооцветяване (едно животно от всяко състояние: STD, HFD 1 d, HFD 3 d, HFD 8 d) са получени със същите параметри (561 nm лазерна мощност, усилване и изместване на фотоумножителя). Използвайки софтуера ImageJ, интензивността на PSA маркирането на секция беше двустранно количествено определена върху избрана област, съответстваща на дъгообразното ядро. Интензитетът на етикетиране е измерен на 5 секции на животно. Зъбната извивка беше избрана за контролна зона. За проучването в големи полета сеченията бяха наблюдавани с помощта на вертикален светлинен микроскоп Axio Imager 2 (Zeiss), оборудван с моторизирана сцена. Цели мозъчни секции бяха сканирани автоматично под обектива 40 ×. Големи изображения с висока разделителна способност са генерирани със софтуера Axiovision и модула MosaiX (Zeiss).

Уестърн блотинг.
Електрофизиологични записи.
Статистически анализ.

Дефицитът на PST-1 ензим нарушава хомеостатичния контрол на приема на енергия след въвеждане на HFD. A, Представителен PSA имунооцветяване в дъгообразно ядро ​​на PST-1 +/+ и PST-1 -/- мишки, хранени с HFD за 1 d. Б., Енергиен прием на PST-1 +/+ и PST-1 -/- мишки, хранени с HFD за 5 дни. Данните са средни ± SEM. n = 6 PST-1 +/+ мишки и n = 12 PST-1 -/- мишки. Групите бяха сравнени с помощта на t тест на Student.

Дискусия

Хипоталамусната пластичност може да се определи като адаптивен процес, насочен към интегриране на промените в условията на околната среда и физиологичните състояния (Oliet, 2002; Prevot, 2002; Ebling and Barrett, 2008). Тук съобщаваме, че промяната в диетата е друга ситуация, водеща до преоборудване на хипоталамусната невронална мрежа. Всъщност постоянното поглъщане на мазнини увеличава честотата на миниатюрни възбуждащи постсинапични течения в POMC невроните, което категорично предполага синаптична реорганизация на тези клетки (Pinto et al., 2004). В това проучване не открихме причинно-следствената връзка между тези електрофизиологични данни и модификацията на приема на храна след въвеждане на HFD, което изисква индуцирано и целенасочено инхибиране на PSA-медиирана синаптогенеза в POMC клетки. Въпреки това, (1) свръхекспресията на PSA предшества поведенческите промени, (2) и двете, HFD-индуцирано POMC пренареждане и постепенното възстановяване на енергийния прием са чувствителни към EndoN, и (3) анорексигенните POMC неврони се включват в адаптивни хомеостатични процеси, които поддържат енергийна хомеостаза (Cone, 2005). В резултат на това HFD-индуцираното PSA-зависимо POMC преоборудване може да обясни хомеостатичния отговор на хранителните мазнини.

Въпреки че ролята на меланокортиновата система в адаптацията на приема на храна в отговор на вариациите в хранителните условия вече е предложена (Butler et al., 2001; Pillot et al., 2011), синаптичната реорганизация на дъговидните POMC неврони сега трябва да бъде счита за ключов компонент във физиологичната обратна връзка. Независимо от това, не можем да изключим нито синергичен ефект, дължащ се на огледално синаптично пренареждане на орексигенни клетки, например неврони NPY/AgRP. Допълнителните защити срещу метаболитен дисбаланс също включват несинаптични механизми, като стимулирано от HFD регулиране на експресията на POMC (Ziotopoulou et al., 2000). Тъй като обръщането на клетките в хранителните вериги се инхибира при затлъстели мишки (McNay et al., 2012), обновяването на хипоталамусните клетки може също да допринесе за хомеостатичния отговор на хранителните мазнини. Следователно хомеостатичният контрол на енергийния баланс със сигурност е консолидиран чрез комбинация от няколко свързани с пластичността процеси от бързи фармакологични до по-бавни морфологични промени. За съжаление, всички тези механизми за мозъчна безопасност очевидно са изпреварени, когато калоричното налягане се поддържа.

Интересното е, че молекулярният скрининг на пластични събития в хипоталамуса на HFD мишки с помощта на масиви с ниска плътност предполага кратка и специфична за дъгата модификация в клетъчните взаимодействия. Въпреки че меланокортиновата система е широко разпространена невронална мрежа, индуцираната от диетата синаптична пластичност изглежда засяга само дъговидните, вероятно от първи ред, неврони. Следователно, мишените надолу по веригата на дъговидните POMC или AgRP неврони, като паравентрикуларни MC4R-позитивни неврони, които са от решаващо значение за хомеостатичния отговор на хранителните мазнини (Butler et al., 2001), могат да предадат повишения анорексигенен тонус от дъгообразното ядро ​​без специфичен синаптик ремоделиране.

В тази статия докладваме PSA-зависим контрол на телесното тегло. Обезогенният ефект на EndoN може да бъде свързан с промяна в регулирането на приема на храна, но не е изключен и ефект върху разхода на енергия. Всъщност POMC невроните управляват и „факултативната“ термогенеза, която изгаря излишните калории по време на изобилие. От друга страна, възстановяването на глюкозен толеранс не е чувствително към EndoN, което предполага, че PSA-зависимото преустройство на невроните не е от решаващо значение за поддържане на глюкозната хомеостаза. По този начин, PSA-зависимата пластичност на хипоталамуса изглежда действа върху специфични физиологични реакции, като например регулирането на приема на храна. Това беше неочаквано, предвид широкия спектър на действие на меланокортиновата система върху периферния метаболизъм (Mountjoy, 2010). Въпреки това, доколкото ни е известно, хормоналната стимулация на POMC преустройството на невроните също не променя хомеостазата на глюкозата.

Изглежда, че синаптичната активност върху POMC невроните насърчава хомеостатичен отговор на поглъщане на хранителни мазнини, т.е.прогресивно намаляване на приема на храна в продължение на една седмица. Промяната в свързаността на хипоталамусния неврон продължава няколко месеца, въпреки че HFD продължава (Horvath et al., 2010). Въпреки това, различните резултати при краткосрочно и дългосрочно излагане на HFD могат да бъдат свързани с лептинова резистентност при индуцирани от диета затлъстели животни, ситуация, при която повишените нива на лептин вече не поддържат POMC изстрелване на неврони (Cowley et al., 2001; Enriori и др., 2007; Diano et al., 2011).

Идентифицирахме PSA като актьор надолу по веригата, необходим за индуцирано от диетата преоборудване на POMC неврони. Полисиалилирането е повсеместен механизъм, открит в няколко хипоталамусни процеса, които включват модификации в клетъчните взаимодействия (Theodosis et al., 1991). Следователно, това вероятно не е специфично за зависимата от диетата синаптична пластичност на дъговидните POMC неврони. По-скоро това би могло да се счита за обикновен разрешителен процес, който може да бъде набран в други описани по-рано хормонално пренареждане на тези неврони (Pinto et al., 2004; Gao et al., 2007; Gyengesi et al., 2010; Yang et al ., 2011). В допълнение, съгласно транскриптомния анализ, други регулатори на динамичните клетъчни взаимодействия и синаптогенезата също могат да участват в индуцираната от диетата хипоталамусна пластичност. Всъщност синдекан-3 и синаптотагмин-4 са обещаващи цели за контрол на затлъстяването и свързаните с него заболявания (Strader et al., 2004; Zhang et al., 2011).

Биологични медиатори, които насърчават индуцирана от диетата хипоталамусна пластичност, не са изследвани в това проучване, но лесно може да се предположи, че метаболитните хормони, които действат върху енергийния метаболизъм чрез своите невротрофни свойства, могат да участват в този физиологичен механизъм (Pinto et al., 2004; Abizaid et al., 2006; Coppola et al., 2007; Andrews et al., 2008; Chiu and Cline, 2010; Yang et al., 2011). Лептинът е един от предполагаемите кандидати. Нивата на лептин в кръвта бързо се повишават след 3 дни HFD (Wang et al., 2001). Това е в съответствие с разширяването на мастната маса, открито в нашия модел. Следователно, лептинът може да насърчи синаптичната реорганизация на POMC невроните, за да инхибира приема на храна в допълнение към неговия пряк стимулиращ ефект върху POMC невроналната активност. Приносът на самите хранителни вещества и/или техните метаболити в този процес също трябва да се има предвид. Например, получените от мазнини ендоканабиноиди са основни компоненти на оста на червата и мозъка и могат да предизвикат синаптични промени в мозъка (Crosby et al., 2011; Lafourcade et al., 2011; Bermudez-Silva et al., 2012). От друга страна, изглежда, че свързаните със стреса сигнали не участват в индуцираната от диетата хипоталамусна пластичност, тъй като познати условия, като повторно излагане на HFD, все още произвеждат регулиране на маркера за пластичност PSA, докато новостта в храните не е достатъчна, за да предизвика този отговор.

Тъй като пластичността на хипоталамуса изглежда широко запазен процес (Peinado et al., 2002; Pinto et al., 2004; Ebling and Barrett, 2008; Appelbaum et al., 2010; Baroncini et al., 2010), индуциран от диета хипоталамус пластичността може да присъства и при хората. Всъщност хаплоинсуфициентността на BDNF, типичният пермисивен фактор за пластичност на мозъка, е свързана със затлъстяването в началото на детството (Han et al., 2008). Освен това две неотдавнашни проучвания за асоцииране на големи човешки кохорти съобщават за силна връзка между висок индекс на телесна маса и полиморфни локуси, чиито съседни гени са силно експресирани в мозъка и изглежда участват в развитието и/или активността на невроните ( Thorleifsson et al., 2009; Willer et al., 2009). По този начин тези проучвания подчертават решаващата роля, която пластичността на мозъка може да играе при регулирането на приема на храна и енергийната хомеостаза и при хората.

В заключение, нашите открития носят нови прозрения в регулирането на приема на храна. Ние показваме, че меланокортиновата система бързо се адаптира към погълнатата храна. Индуцираното от диетата преоборудване на POMC невроните оказва влияние върху приема на енергия. Невъзможността да се започне индуцирана от диетата хипоталамусна пластичност е обезогенна и следователно може да бъде нов фактор в етиологията на метаболитните заболявания.