Налице е декларация за тази статия

Резюме

Заден план

Акарата Psoroptes cuniculi е често срещан в световен мащаб ектопаразит и най-често срещан в заешките ферми. Това причинява значителни икономически загуби върху търговското отглеждане на зайци, свързани с лошо качество на кожата, намалени нива на зачеване, загуба на тегло, лош растеж и смърт. Предложени са няколко стратегии за лечение на краста, причинени от този акар, вариращи от използването на акарициди, ентомопатогенни гъби, етерични масла и ваксини. Въпреки това, терапията и контролът както на човешката краста, така и на крастата от животни все още се основава главно на употребата на лекарства и химикали като ивермектин, което включва недостатъци, включително генотоксични и цитотоксични ефекти, устойчивост и увреждане на околната среда. Bacillus thuringiensis е бактерия, безвредна за човека, домашни животни и растения, която произвежда силно биоразградими протеини и е използвана в целия свят за биологичен контрол. Целта на тази работа беше да се намери алтернативно лечение, основано на биологичен контрол на краста, причинена от Psoroptes cuniculi, използване на протеинови екстракти от щамове на Bacillus thuringiensis.

Методи

P. cuniculi акари са получени от естествено заразени новозеландски зайци и различни дози протеин от Б. thuringiensis бяха добавени към акарите. Измерихме смъртността и получихме средната летална концентрация и средната летална продължителност. За хистологичен анализ акарите са фиксирани в 10% формалин, обработен съгласно вложената в парафин тъканна техника. Разрезите бяха оцветени с хематоксилин-еозин, за да се наблюдава общата хистологична структура.

Резултати

Тук докладваме за първи път доказателства за инвитро акарициден ефект, причинен от щама GP532 на Б. thuringiensis върху акарата Psoroptes cuniculi, с LC50 от 1,3 mg/ml и LT50 от 68 часа. Хистологични изменения, причинени от Б. thuringiensis върху този акар, включващи наличието на разширени междуклетъчни пространства в базалната мембрана, отделяне на мембраната на перитрофния матрикс и морфологични изменения в колоновидни клетки на червата.

Заключения

Тъй като този акар е задължителен ектопаразит, който засяга зайци, кози, коне, крави и овце, Б. thuringiensis протеиновите екстракти се предлагат като потенциално лечение за биологичен контрол на краста при селскостопански животни.

Заден план

Акарата Psoroptes cuniculi (P. cuniculi) е често срещан в световен мащаб ектопаразит и най-често срещан в заешките ферми. Този акар причинява отит, най-често срещаното заболяване при домашните зайци и основната причина, поради която собствениците търсят ветеринарен лекар. По този начин този паразит засяга общото здраве и хигиена на животните [1]. P. cuniculi заразяването може да причини значителна загуба на тегло, по-неблагоприятни проценти на преобразуване на фуражите, вестибуларна дисфункция и менингит, често усложнен от вторични бактериални инфекции [2]. Това причинява значителни икономически загуби, свързани с лошо качество на кожата, намалени нива на зачеване, загуба на тегло, лош растеж и смърт [3].

Предложени са няколко стратегии за лечение на краста, причинена от P. cuniculi, вариращи от употребата на акарициди, ентомопатогенни гъби и етерични масла до ваксини [4, 5]. Въпреки това, терапията и контролът както на човешката краста, така и на крастата от животни все още се основават главно на употребата на лекарства и химикали като ивермектин [6]. Използването на лекарства, като ивермектин, за борба с този паразит има недостатъци, тъй като има както генотоксичен, така и цитотоксичен ефект. Освен това широкото им използване предизвиква устойчивост, придружена от замърсяване на околната среда [7–10]. Тези факти, свързани с интереса към консумацията на продукти, осигуряващи добро санитарно качество, хигиена и правилно боравене, водят до изследователски усилия за откриване на нови ефективни съединения.

Bacillus thuringiensis (Б. thuringiensis) е Грам-положителна бактерия, безвредна за хората, домашните животни и растенията. Той произвежда силно биоразградими протеини и е използван в световен мащаб за биологичен контрол срещу няколко селскостопански вредители и някои комари, преносители на човешки болести [11, 12], а напоследък се предлага да се използва срещу някои паразити, които засягат здравето на животните и хората. [13]. Над 90% от пазара на биоинсектициди включват продукти на базата на тази бактерия [14], а в световен мащаб има около 60 000 изолати на Б. thuringiensis в публични и частни колекции, които могат да имат специфична инсектицидна активност [15–17]. Целта на настоящата работа е да се изследва акарицидният потенциал на протеиновите екстракти от щамове на Б. thuringiensis, установяване, че щамът GP532 има LC50 от 1,3 mg/ml и действа в кратки моменти (LT50 = 68 часа) в инвитро проучвания. Освен това съобщаваме, че акарицидният ефект на Б. thuringiensis протеиновите екстракти се произвеждат чрез хистологични промени в червата на акарата.

Методи

Декларация за етика

Всички процедури с животни следваха практиките за грижи и експерименти с животни, препоръчани съгласно мексиканските разпоредби (NOM-062-ZOO-1999). Тези разпоредби са в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни от Националния здравен институт (NIH и The Weatherall Report), като се гарантира спазването на международните разпоредби и насоки. Настоящият ръкопис не съдържа клинични проучвания или данни за пациенти.

Изолация на Б. thuringiensis щамове

Трупове на P. cuniculi са взети от проба от струпея от заразения заек от Нова Зеландия и са поставени поотделно в стерилна микроцентрифужна епруветка. Те бяха промити два пъти с натриев хипохлорит 1% и със стерилна вода. След това те бяха поставени поотделно в стерилна микроцентрифужна епруветка, към всяка епруветка бяха добавени 500 μl течна среда Luria-Bertani (LB) и труповете бяха мацерирани със стерилен връх. Епруветките се инкубират при 30 ° С в продължение на 72 часа. След това 100 μl от културата се разреждат с 800 μl стерилна вода и се подлагат на топлинен удар от 60 ° за един час, за да се елиминират гъбичките или да няма спорообразуващи бактерии. Взема се цикъл, засява се в чашка на Петри с твърда LB среда и се инкубира до 24 часа, взема се единична колония и се засява върху HCT среда. Щамовете, които произвеждат кристали, бяха избрани и държани в LB и глицерол 60% [11, 18]. Щамовете се отлагат в Б. thuringiensis колекция от лабораторията по растителна паразитология на Центъра за биологични изследвания (LVP-BRC) към Университета на щата Морелос, Мексико.

Възрастни акари

P. cuniculi акари са получени от пет естествено заразени новозеландски зайци, транквилирани с интрамускулно приложение на кетамин/ксилазин (40 mg/kg и 10 mg/kg). Краста, съдържаща акари, се получава чрез изстъргване от външното ухо, поставя се в дъното на 50 ml епруветки и се държи при 28 ± 2 ° C в продължение на 15 минути, за да се стимулира миграцията на акарите от струпеите [19]. Акарите са идентифицирани с помощта на стереомикроскоп в съответствие с морфологичните особености на техните видове [20] и в биоанализите са включени само възрастни акари, мигриращи най-малко до маркировката, съответстваща на 25 ml височина в тръбата от 50 ml.

Избор на щамове и производство на споро-кристални протеини

Щамове на Б. thuringiensis са получени от колекцията от щамове на LVP-BRC. Тествахме 12 щама, изолирани от трупове на P. cuniculi, и щам GP526, изолиран от Meloidogyne sp, всички те се отглеждат в HCT среда при 28 ± 2 ° C до пълна спорообразуване (72 h). Общите протеини (спори и кристали) бяха възстановени с бактериологична верига и суспендирани в стерилна вода, съдържаща протеазен инхибитор PMSF 100 μM. Общата концентрация на протеин е определена количествено по техниката на Брадфорд [21].

Инвитро биологични тестове за токсичност

Използвана е по-рано описаната техника на потапяне [22], за кратко тридесет възрастни акари са поставени в микроепруветки и 1 ml протеин от Б. thuringiensis беше добавен трикратно за 60 s. Акарите бяха поставени в агари Петри, съдържащи вода и филтърна хартия, и запечатани с Parafilm®, за да се избегне дехидратация. Смъртността се определя и количествено определя микроскопски, като се вземат като мъртви акари тези, на които липсва реакция на стимулация с четка, с постоянна неподвижност в продължение на 5 минути [23, 24]. Биопробите се повтарят 4 пъти в различни дни.

Средна летална концентрация (LC50) и средна летална продължителност (LT50)

Проведохме крива на реакция на дозата, като извършихме 10 повторения за всяка доза и LC50 беше концентрациите, предизвикващи ≥50% смъртност. LC50 беше изчислен с помощта на Probit анализ чрез статистическата програма Polo Plus 2003 [25]. Смъртността се определя количествено на всеки 24 часа, извършва се линеен регресионен анализ и данните се изразяват като нетна смъртност [18].

Хистологичен анализ

Акарите бяха фиксирани в 10% формалин, обработени съгласно вложената в парафин тъканна техника и хистологичните срезове от 6 μm бяха получени с помощта на MR2235 Leica микротом. Секции бяха оцветени с хематоксилин-еозин, десет микроскопски полета бяха оценени във всяка секция и фотодокументирани с анализатор на изображения [26].

Протеинов профил

Пет μg концентриран спорен кристал в разрушаващ буфер се вари в продължение на 10 минути и се центрофугира при 14 000 об/мин за 5 минути [27]. Супернатантата се отделя чрез SDS-полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE) 10% и гелът се оцветява с Coomassie blue.

Резултати

Избор на щамове, производство на споро-кристални протеини и инвитро биопроби

За да се анализира акарицидния ефект на общите протеинови екстракти, получени от 13 щама на Б. thuringiensis, ние киснахме P. cuniculi акари в разтвор с 1 mg/ml общ протеин за 60 s (фиг. 1). Дозата от 1 mg/ml предизвиква смъртност на няколко от тестваните щамове и е тествана за различно време след излагане на Б. thuringiensis. След 24, 48 и 72 часа след третирането открихме максималната токсичност при щамове GP532 и GP392 за 24 часа (11.48 ± 4.6 и 11.11) и 48 часа (18.88 ± 7.92 и 17.037 ± 4.41) (Таблица 1). След 72 часа наблюдавахме най-висока токсичност при щамове GP532, GP522, GP392, GP871 и GP873, предизвикващи 34,62% ​​± 5,95, 29,44% ± 3,07, 29% ± 3,39, 28,8% ± 3,42 и 27,9% ± 3,98, съответно, докато контролната група, която наблюдавахме 16,4% ± 2,72 от смъртността.

акарициден

Индуцирана токсичност 72 h след инкубация на P. cuniculi акари за 60 s с общи протеини, получени от 13 различни щама на Б. thuringiensis. Показана е средна стойност ± SD от процента на смъртност. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 и ***P ≤ 0,001, тест на Крускал-Уолис

Щамът, който индуцира най-висока токсичност, беше GP532. След това тествахме щам GP532, увеличавайки времето за потапяне от 60 s на пет минути. С това увеличаване на времето на потапяне наблюдаваме повишаване на токсичността от 34,64% до 52,03% след 72 часа след лечението, докато в контролната група не наблюдаваме значим ефект върху смъртността (от 16,46% до 16,94%). Това увеличение до 52% представлява повече от 300% (16,94 се приема за 100%), което показва значителна ефикасност на щама GP532 при индуцирането на токсичност на акари. Алтернативно, тествахме ефикасността на търговския акарицид ивермектин, който произвежда 98% от смъртността след 48 часа след лечението (Таблица 2).

Средна летална концентрация (LC50) и средна летална продължителност (LT50)

Впоследствие оценихме различни концентрации на щам GP532 за 5 минути потапяне и анализирахме данни с анализ на оцеляването на Probit, за да определим LC50. Установихме, че LC50 се постига с концентрация от 1,3 mg/ml (фиг. 2а).

Доза (а) и зависи от времето (б) цитотоксичност, предизвикана от потапяне на акари в протеини от щама GP532 за 5 минути (средно ± SD, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 и ***P ≤ 0,001, тест на Ман Уитни)

За да се определи токсичността на щама GP532 по различно време, TL50 се оценява на всеки шест часа след потапяне и се анализира чрез линеен регресионен анализ, като се установява TL50 от 68 часа с корелация от 0,94 след потапяне на акари в продължение на 5 минути (Фиг. 2b ).

Хистологичен анализ

Освен това анализирахме хистоархитектурата на акарите (фиг. 3), наблюдавайки наличието на разширени междуклетъчни пространства в перитрофния матрикс на червата след 1 минута лечение с 1 mg/ml GP532. Освен това наблюдавахме по-голямо количество мазнини във форма на вакуола във вентрикуларната зона. Също така беше забелязано, че повечето от третираните акари нямат чревно съдържание (фиг. 3в), докато акарите в контролната група нямат промени в червата и те имат чревно съдържание (фиг. 3а). Камерната тъкан в контролните акари показва разпръснати мастни запаси (фиг. 3b), докато при третирани акари наблюдаваме наличие на разширени междуклетъчни пространства в базалната мембрана, отделяне в мембраната на перитрофния матрикс и пълно изпразване на чревното съдържимо (фиг. 3в, стрелки), а във вентрикула наблюдаваме наличието на мазнини (фиг. 3d, стрелки). В тъканта, третирана с ивермектин, наблюдаваме липса на вакуолизация и на мастни отлагания както в червата, така и в камерата (фиг. 3д, е).

Фотомикрография на надлъжни разрези в контрола (а, б), третирани акари със щама GP532 от Б. thuringiensis (° С, д) или с ивермектин (д, е). LU: лумен на червата, MP: перитрофична матрица, EC: ектоперитрофично пространство, MB: базална мембрана, CI: чревно съдържание, Va: вакуола, VEM: средна камера, Ov: яйчник. Стрелките показват изменение на чревната базална мембрана или вакуолни мастни отлагания във вентрикула, H & E-X40

Нещо повече, наблюдавахме морфологични промени в колоновидни клетки на червата при третирани акари (фиг. 4б), докато в тъканта на контролните акари не наблюдавахме промени в тези клетки (фиг. 4а). При третирани с ивермектин акари не наблюдаваме промените, предизвикани от Б. thuringiensis в перитрофичния матрикс на червата, в камерната зона или в колоновидни клетки (фиг. 4в).

Представителен образ на структурата на колоновидните клетки в акарата P. cuniculi без лечение (а) или след лечение със щама GP532 от Б. thuringiensis (б) или ивермектин ° С, и съответните им изображения чрез релефния филтър (a1, b1, c1). Стрелките показват наличие на разширени междуклетъчни пространства на колонен епител по отношение на перитрофния матрикс. Лента = 20 μm

В централната нервна система на акарата синганглионът е наблюдаван хистологично подобно на контролната група (фиг. 5а) и при третирани с ивермектин акари (фиг. 5б) и Б. thuringiensis (Фиг. 5в).

Фотомикрография на надлъжни разрези в нервната система на контролните акари (а) или третирани със щама GP532 от Б. thuringiensis (б) или ивермектин (° С). Syn: Synganglion

Електрофоретичен профил на щам GP532 от Б. thuringiensis

Впоследствие анализирахме протеиновия профил на щам GP532, отбелязвайки, че основните ленти в протеиновия профил на щам GP532 имат молекулни тегла в диапазона от 25 до 135 kDa (Фиг. 6).

Електрофоретичен профил на щам GP532 от Б. thuringiensis

Дискусия

Електрофоретичният профил на щама GP532 показва основна лента от около 135 kDa. Съобщава се, че един от протеините, произвеждани от Б. thuringiensis серовариета kurstaki HD73 щам е Cry1A, който има приблизително молекулно тегло 133,3 kDa [48]. Също така, действието на Б. thuringiensis върху акарите с пчеларско значение, Разрушител на вароа, е съобщено и активният щам срещу този паразит има 100% идентичност с Б. thuringiensis серовариета kurstaki HD73 щам [18].

За акарите механизмът на действие на Б. thuringiensis е неизвестен. Наличието на ензими като трипсин, алкална фосфатаза и някои аминопептидази върху храносмилателната физиология на рода Псороптес [49], предполагат, че промени в чревните колоновидни клетки, наблюдавани през P. cuniculi, може да се дължи на активиране на Б. thuringiensis протоксини като Cry1A, който в мехурчестите мехурчета на черупките на Lepidoptera индуцира промени, подобни на порите. Cry1A действа чрез специфичен рецептор, „Рецептор А”, аминопептидаза-N с молекулно тегло 170 kDa, който е пречистен от мембраните на четката на чревните епителни клетки на H. virescens [50]. При други Lepidoptera, молекулярното тегло на отчетените рецептори е 120, 140 и 170 kDa [51]. В настоящото проучване не анализирахме токсичното действие на специфични протеини, изолирани от Б. thuringiensis върху акарата P. cuniculi, бъдещите проучвания обаче ще се фокусират върху тези проучвания, както и последователността на токсичния протеин срещу акарата P. cuniculi да познава механизма на действие на Б. thuringiensis върху акари.

В инвитро тестове, по време на смъртта на акарите, предизвикана от Б. thuringiensis наблюдавахме контракции преди смъртта. Това явление е съобщено и в други инвитро анализи с ивермектин. При бозайниците, според моделирането на механизма на действие, ивермектинът се свързва и той се транспортира чрез мембранен Р-гликопротеин и активира затворени от глутамат хлоридни канали, пречещи на нервната система и мускулната функция, усилвайки инхибиторната невротрансмисия [36, 52]. В нашето изследване обаче не наблюдаваме промени в синганглиона, който регулира нервните импулси в акарата; следователно е възможно контракциите да се отдадат на разграждане на мускулния гликоген, съчетано с нестабилността, причинена от Б. thuringiensis хомеостаза в храносмилателната система на акарата.

Заключения

Няколко Б. thuringiensis щамове, изолирани от P. cuniculi тествани в тази работа, имах инвитро акарициден ефект върху този акар. Щамът GP532 имаше най-висок ефект при нашите експериментални условия, с LC50 от 1,3 mg ml -1, LT50 от 68 часа и предизвиква хистологични промени в червата на акарата.