Разкриване на авторите: П. В. Бхат, Д. Манолеску и А. Сима, няма конфликт на интереси.

all-trans

Daniel-Constantin Manolescu, Aurelia Sima, Pangala V. Bhat, All-trans Retinoic Acid понижава серумните концентрации на ретинол-свързващ протеин 4 и повишава чувствителността към инсулин при мишки с диабет, Journal of Nutrition, том 140, брой 2, февруари 2010 г., страници 311 –316, https://doi.org/10.3945/jn.109.115147

Резюме

Последните изследвания показаха, че повишеният серумен ретинол-свързващ протеин 4 (RBP4), секретиран от мастната тъкан, играе роля в развитието на системна инсулинова резистентност, а понижаването на RBP4 подобрява инсулиновата чувствителност. Тези наблюдения дават основание за разработването на нови антидиабетни средства, насочени към намаляване на серумните концентрации на RBP4. В това проучване ние се опитахме да определим дали приложението на ретиноева киселина (RA) намалява серумния RBP4 и потиска инсулиновата резистентност при диабетни ob/ob мишки. All-trans RA [100 μg/(mouse⋅d) в царевично масло] се прилага чрез стомашна интубация на група ob/ob мишки, като контролната група получава носителя за 16 дни. Проследява се телесното тегло и приема на храна. Проведени са тестове за глюкоза и инсулинов толеранс. Количествено определихме серумния RBP4 и ретинола чрез Western blot и HPLC, съответно. Лечението с RA намалява телесното тегло (P

Въведение

Изцяло транс-ретиноевата киселина (RA), 4 активният метаболит на витамин А, е от съществено значение за ембриогенезата и правилното поддържане на епителната структура (1, 2). Много биологични функции на RA се медиират от RA рецептори (RAR и RXR) (3). RA също е мощен химиопрофилактичен агент (4). Клиничните изследвания показват, че тя предизвиква пълна ремисия при пациенти с остра промиелоцитна левкемия (4, 5). Понастоящем RA се прилага и за лечение на рак на простатата или невробластом, а различни други форми на RA (ретиноиди) представляват химиопрофилактични подходи при пациенти с премалигнени лезии като актинична кератиноза, левкоплакия и цервикална дисплазия или след терапия на първична кожа, орално, рак на белия дроб и гърдата (6, 7). Въпреки че RA е обещаващо противораково лекарство, ефикасността му срещу други заболявания, като диабет, не е изследвана.

Ние и други показахме, че диетичният RA драстично потиска нивата на циркулиращия ретинол при гризачи (29–31). Въпреки че RBP4 не е измерен в тези проучвания, нивата му може да са намалени, тъй като ретинолът е свързан с RBP4 в серума. Тъй като RA има понижаващи ретинол-RBP4 ефекти, ние предположихме, че лечението на диабетни мишки с RA може да доведе до потискане на инсулиновата резистентност.

Материали и методи

Протоколът за изследване е одобрен от институционалния комитет за грижи и употреба на животните към изследователския център на Университета в Монреал. Шестнадесет женски мишки B6.V-Lep/J ob/ob на възраст 9 седмици са получени от лабораторията Jackson. Те бяха разделени на 2 групи от по 8 мишки всяка: 1 контролна (RA -) и 1 RA-допълнена (RA +). Мишките бяха настанени (4 на клетка) при контролирани от околната среда условия и 12-часов светлинен/тъмен цикъл със свободен достъп до вода и стандартна диета с гризачи за гризачи (№ 2018, 18% протеин за гризачи, Harlan Teklad). Съставът на диетата беше (g/kg): суров протеин, 188; суров нефт, 60 (общо наситени, 9,6; общо мононенаситени, 12,8; и общо полиненаситени, 34,1), сурови влакна, 38; въглехидрати, 500 (нишесте, 450; и захар, 50), минерална смес, 32,05; витаминен микс, 2,9; и енергия, 13,7 kJ/g. Те бяха аклиматизирани в новата си среда за 1 седмица преди началото на експеримента. Телесното тегло и приема на храна се измерват ежедневно.

Десетседмични постни мишки (щам C57BL/6), получени от Charles River Labs и хранени със стандартна диета с гризачи за гризачи, бяха изследвани, за да се определят нормалните нива на RBP4, ретинол и техните съотношения.

Подготовка и приложение на RA.

All-trans RA (Sigma-Aldrich) се разтваря в царевично масло и се доставя в доза от 100 μg в 100 μL на мишките чрез стомашна интубация всеки ден сутрин. RA - мишките получиха само превозното средство, царевично масло. Добавянето на RA продължава 16 дни. Тъй като RA е относително нестабилно съединение, разтворът се приготвя ежедневно и стабилността се проверява чрез HPLC. За да се избегне възможен пробив на RA от излагане на светлина, всички операции с RA се предприемат при слаба светлина.

Измерване на кръвна глюкоза, интраперитонеална глюкоза и тестове за толерантност към инсулин.

Мишките бяха лишени от храна в продължение на 4 часа и концентрациите на глюкоза в кръвта бяха измерени в кръвни проби на d 9 (по време на лечението) и d 16 (последния ден от лечението), когато бяха проведени интраперитонеални тестове за толеранс към глюкоза и инсулин (IPGTT и IPITT). За IPGTT и IPITT, мишките получиха инжекции съответно на глюкоза (1 g/kg телесно тегло) и човешкия редовен инсулин (1 IU/kg телесно тегло). Концентрациите на кръвната глюкоза се определят количествено чрез глюкометър AccuCheck (Roche) от кръвни проби на 0, 20, 40, 60, 90 и 120 минути след прилагане на глюкоза и инсулин.

Събиране и съхранение на серумни проби.

След като мишките бяха лишени от храна през нощта, кръвта беше събрана в вакуунерни епруветки, съдържащи активатор на съсирване на основата на силикагел и предварително увити с алуминиево фолио, за да се сведе до минимум излагането на светлина. Пробите незабавно се обработват в тъмно помещение и серумът се получава чрез центрофугиране при 8165 × g при 4 ° C (Eppendorf Centrifuge, модел 5415C), след което се съхранява в 1,5 ml кафяви криотруби Eppendorf при -80 ° C до анализ. Те бяха размразени веднъж и едновременно анализирани за ретинол и RBP4.

Екстракция на ретинол от серумни проби за HPLC.

Ретинолът от серумните проби се екстрахира с бутанол/ацетонитрил (равни обеми) по същество, както е описано от McClean et al. (32), с изключение на това, че методът е приложен за по-малки обеми на пробата. Пробите, съхранявани при -80 ° С, се размразяват върху лед и се центрофугират за 10 минути при 4 ° С при 735 × g (Eppendorf Centrifuge, модел 5415C), за да се получат бистри супернатанти. След това 200 μL серум се прехвърлят в боросиликатна епруветка, обвита в алуминиево фолио и се добавят 200 μL бутанол: ацетонитрил (1: 1). Сместа се завихря за 1 min и след добавянето на 72 mg хидратиран K2PO4 в 20 μL вода, се завихря отново за 30 s. Екстракционната смес се центрофугира при 2620 × g за 15 минути в Sorval RC3C Plus центрофуга, предварително охладена до 4 ° С. Общо 100 μL бистър супернатант се инжектира в HPLC системата. Проведени са проучвания за възстановяване с добавяне на ретиноиди (5-50 ng в 100 μL) към 3 отделни серумни проби. Възстановяването на ретинол при този метод на екстракция е> 99%.

HPLC на серумен ретинол.

Системата HPLC се състоеше от модел Shimadzu LC-10ADVP, оборудван с автосамплер и охладителна система SIL-HTC (Man-Tech). Ретинолът се отделя на аналитична колона Partisil 10-ODS (250 × 4,5 mm, Grace Discovery Sciences) и се елуира с подвижна фаза ацетонитрил: вода (65:35), съдържаща 10 mmol/L амониев ацетат, при скорост на потока от 1,2 ml/min. Ретинолът се открива от детектор с фотодиодни решетки (модел Shimadzu SPD-M10 AVP), който събира спектри между 200 и 500 nm. Кривите на калибриране за ретинол са получени със стандартни чисти разтвори на ретинол (Sigma-Aldrich). Идентифицирани са характерни UV спектри и времена на задържане за ретинол и зоните на пикове са измерени при λmax-330 в система за данни на модел Shimadzu SZ-228. Границата на откриване за ретинол беше 2 pg.

Измерване на серумен RBP4 чрез количествено Western blotting.

Количеството на серумния RBP4 е количествено, както е описано от Graham et al. (28). Чистият човешки RBP4 в урината (Sigma-Aldrich) служи като стандартен протеин за количествено определяне на RBP4. При анализа бяха използвани стандартни разтвори от 20, 40 и 80 ng/μL RBP4 и 1-μL серумни проби. Протеините се разделят върху 15% трис-глицинови SDS-PAGE гелове и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани Hybond (Amersham). Петната бяха инкубирани през нощта при 4 ° С с първично антитяло, анти-RBP4, повдигнато срещу човешки RBP4 с пълна дължина, което се препоръчва за откриване на предшественик и зряла мишка, плъх и човек RBP4 (Santa Cruz Biotechnology). Първичното антитяло се разрежда 1: 700. Впоследствие пепелите се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура с конюгирано вторично антитяло от хрян пероксидаза (козя анти-заешка IgG-пероксидаза от хрян, разредено 1: 3000, Santa Cruz Biotechnology). Комплексите на антителата се визуализират чрез ензимна хемилуминесценция (комплект за хемосубстрат от Perkin Elmer) и лентите се определят количествено със софтуера ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics). Стандартните калибрационни криви на RBP4 (криви от полином от втори ред, r 2> 0,99) за всеки отделен гел са начертани, за да се изчислят неговите концентрации в серума.

Статистически анализ.

Резултатите са представени като средно ± SEM. Значимостта се оценява чрез еднопосочен ANOVA, последван от анализ на Нюман-Килс (софтуер Prism Graph Pad). Използва се несдвоен t тест на Student за сравнение на площта под кривата (AUC) глюкоза и AUC инсулин. Разликите се считат за значителни при P Фиг. 1) и продължават да го правят в продължение на 13 дни, след което постепенно започват да наддават с ниска скорост. От друга страна, мишките от групата на RA растат нормално и напълняват по време на експеримента. Телесното тегло на RA + мишките е по-малко от това на RA - мишките, започвайки от d 4 от изследването (P Фиг. 1). На d 16 мишките RA + тежат със 7.4% по-малко от RA - контролите (P - [5.43 ± 0.14 g/(mouse⋅d)] и RA + (5.17 ± 0.13 g/(mouse⋅d)) групи.

Няколко автори съобщават, че витамин А участва в регулирането на затлъстяването и енергийния баланс (35, 36). Мишките, получаващи витамин А отслабнаха (37) и наскоро беше забелязано, че затлъстелите мишки, генерирани от диета с високо съдържание на мазнини, отслабват, когато консумират диета с RA за 5 седмици (38). Въпреки че RA потиска инсулиновата резистентност в това проучване, то не понижава базалните нива на глюкоза. Приложихме RA перорално на мишки с диабет за 16 дни и те загубиха 10% от теглото си. Тъй като приемът на храна на лекувани с RA мишки не се различава от този на нетретираните контроли, загубата на тегло на тези мишки отразява подобрение в енергийните разходи.

На гладно, ретинолът, свързан с RBP4, циркулира в кръвта в приблизително моларно съотношение 1: 1 и проучванията показват, че малко количество ретинол, несвързан с RBP4, също присъства в циркулацията (43, 44). Въпреки че теоретично съотношението ретинол: RBP4 в кръвта е 1, измереното съотношение е> 1 поради наличието на свободен ретинол в циркулацията. Motani et al. (42) съобщават за серумно съотношение ретинол: RBP4 от ∼1,78 при слаби мишки, което е малко по-високо от нашите стойности при такива животни (1,38; Фиг. 4). Няколко автори са открили връзка между съотношението серумен ретинол: RBP4 със затлъстяването и диабет тип 2 (16, 45, 46), предполагайки, че съотношението серумен ретинол: RBP4 е по-подходящ показател за диабет тип 2, отколкото само серумен RBP4. В нашите проучвания установихме значително увеличение на съотношението серумен ретинол: RBP4 при ob/ob мишки в сравнение с постни мишки и лечението с RA понижи съотношението с 20%. Тъй като намаленото съотношение на серумен ретинол: RBP4 е в съответствие с подобряването на глюкозната хомеостаза, предлагаме то да бъде използвано за тестване на ефикасността на лекарства, които подобряват гликемичния индекс. Необходима е обаче повече работа в няколко инсулиноустойчиви животински модела, за да се засили тази хипотеза.

Интересното е, че значително количество несвързан ретинол (въз основа на съотношението ретинол: RBP4), потенциален токсин, присъства в циркулацията на ob/ob мишки. Не е ясно дали излишъкът на свободен ретинол в серума допринася за патогенезата на диабет тип 2. В този контекст, скорошни проучвания съобщават за по-голямо съотношение ретинол: RBP4 в цереброспиналната течност, отколкото в серума на участниците с идиопатична интракраниална хипертония, което показва участието на свободен ретинол в цереброспиналната течност в патогенезата на интракраниалната хипертония (47, 48).

В обобщение, тази работа показва, че лечението с RA значително подобрява инсулиновата чувствителност и глюкозната хомеостаза при инсулинорезистентни ob/ob мишки. Нашите резултати подкрепят антидиабетната активност на RA, която може да се окаже от клинично значение и да предостави нови стратегии за лечение при лечение на диабет тип 2. В допълнение, съотношението серумен ретинол: RBP4 може да осигури терапевтичния потенциал на лекарствата при лечение на диабет тип 2.