Роли Формален анализ, разследване, администриране на проекти, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

киселина

Отдел по клинична наука, Университет в Берген, Берген, Норвегия, Катедра по сърдечни заболявания, Университетска болница Хаукеланд, Берген, Норвегия

Разследване на роли, администриране на проекти, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение за клинична наука, Университет в Берген, Берген, Норвегия

Роли Формален анализ, ресурси, писане - преглед и редактиране

Институт по физиологична химия, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Концептуализация на роли, официален анализ, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отделение за клинична наука, Университет в Берген, Берген, Норвегия

Роли Формален анализ, ресурси, писане - преглед и редактиране

Институт по физиологична химия, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Роли Концептуализация, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Отдел по клинична наука, Университет в Берген, Берген, Норвегия, Катедра по сърдечни заболявания, Университетска болница Хаукеланд, Берген, Норвегия

  • Карине Линдквист,
  • Бодил Бьорндал,
  • Кристин Ренате Росман,
  • Асбьорн Свардал,
  • Сет Холстрьом,
  • Ролф Кристиян Берге

Фигури

Резюме

Цитат: Lindquist C, Bjørndal B, Rossmann CR, Svardal A, Hallström S, Berge RK (2018) Аналог на мастна киселина, насочен към митохондриите, оказва понижаващ плазмен ефект на триацилглицерол при плъхове с нарушена биосинтеза на карнитин. PLoS ONE 13 (3): e0194978. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0194978

Редактор: Катрин Муние, Университет на Квебек и Монреал, КАНАДА

Получено: 15 септември 2017 г .; Прието: 14 март 2018 г .; Публикувано: 28 март 2018 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Тази работа беше финансово подкрепена от Фондация за научни изследвания в Берген и Регионалната здравна служба в Западна Норвегия (911945) към CL. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Един от рисковите фактори, характеризиращи метаболитния синдром, е дислипидемия, включително повишен плазмен триацилглицерол (TAG) [1]. Метаболитният синдром е свързан с повишен сърдечно-съдов риск [2–5], при който сърдечно-съдовите заболявания са основната причина за смърт в световен мащаб [6]. Безалкохолната мастна чернодробна болест се определя като натрупване на липиди в черния дроб, също свързана с дислипидемия [7] и се обсъжда или като чернодробна проява на метаболитен синдром, или като независим сърдечно-съдов рисков фактор [8]. Между 20–40% от общото население в западните страни имат безалкохолно мастно чернодробно заболяване [9]; не са определени обаче одобрени лечения освен промяна в диетата и повишено упражнение. Има няколко събития, причиняващи прекомерно интрахепатално натрупване на липиди, като повишено усвояване на липиди от черния дроб, повишена липогенеза и нарушен синтез и/или секреция на частици липопротеини с много голяма плътност (VLDL), предотвратяващи отстраняването на TAG от черния дроб [10, 11]. Безалкохолното мастно чернодробно заболяване се нарича митохондриално заболяване, включително дисфункционално окисление и биогенеза на митохондриалните мастни киселини [11, 12], поради което лекарствата, насочени към митохондриалната функция, могат потенциално да подобрят както мастната чернодробна болест, така и плазмената TAG.

3- (2,2,2-триметилхидразиний) пропионат дехидрат (мелдоний; търговска марка Mildronate), е аналог на карнитиновия предшественик γ-бутиробетаин, като по този начин инхибира γ-бутиробетаин хидроксилазата, потискайки биосинтеза на карнитин, което води до намалена концентрация на карнитин [21, 22]. Тъй като този механизъм стимулира метаболизма на глюкозата в сърцето, той се използва като кардиопротективно лекарство [23]. Доказано е обаче, че намаляването на нивата на чернодробния карнитин дава развитие на затлъстяване на черния дроб при животните [22, 24]. По този начин, лекуваните с милдронат плъхове могат да се използват като модел за изчерпване на карнитин [22].

2- (тридек-12-ин-1-илтио) оцетна киселина (C15H26O2S; 1-тройна ТТА) има същата дължина като палмитиновата киселина, в която β-въглеродът е заместен със серен атом. В допълнение, той има тройна връзка в ω-края, което го прави устойчив както на β-окисляване, така и на ω-разграждане. 1-тройна ТТА е въведена от Lindquist et al. [25] като митохондриален активатор и пролифератор при плъхове. Доказано е, че увеличава чернодробното окисление на митохондриалните мастни киселини въз основа на in vitro анализ за окисление на палмитоил-КоА, анализи на ензимна активност и генна експресия на ензими, участващи в митохондриалното β-окисление и карнитиновата совалка. Той също така значително понижава съдържанието на TAG в плазмата и черния дроб, като същевременно намалява нивата на АТФ в черния дроб. Също така измерихме нивата на карнитин в плазмата, където L-карнитин, ацилкарнитини и предшественикът на карнитин γ-бутиробетаин очевидно бяха намалени в сравнение с контрола. Следователно, ние предположихме, че 1-тройният TTA може да бъде потенциално лечение на наднормено тегло и затлъстяване на черния дроб.

Тъй като беше показано, че 1-тройният TTA повишава митохондриалната активност и липидния катаболизъм в черния дроб, по-ниските нива на TAG и нивата на карнитин в плазмата, целта на настоящото проучване е да се изследва дали 1-тройният TTA може да повлияе благоприятно на липидния метаболизъм, когато карнитиновата биосинтеза е нарушена.

Материали и методи

Изследване на животни

Количествено определяне на плазмените и чернодробните параметри

Липиден анализ.

Чернодробните липиди бяха извлечени от замразени проби съгласно Bligh and Dyer [28], изпарени под азот и повторно разтворени в изопропанол преди анализ. Липидите от черния дроб и плазмата са измерени ензимно на система Hitachi 917 (Roche Diagnostics GmbH, Манхайм, Германия), като се използва триацилглицерол (Triglycerides GPO-PAP, 11730711) от Roche Diagnostics и фосфолипиден комплект (Phospholipids FS, Ref 157419910930) от DiaSysSys Diagnostic Systems GmbH, Holzheim, Германия).

Плазмен карнитин и предшественици на карнитин.

L-карнитин, триметилизин, у-бутиробетаин и ацетилкарнитин се анализират в плазмата чрез високоефективна течна хроматография-MS/MS, както е описано от Vernez et al. [29] с някои модификации [30].

Чернодробни високоенергийни фосфати.

Лиофилизирани биопсии бяха взети от черния дроб и съхранявани в течен азот. Подготовката на пробата и измерването с високоефективна течна хроматография на ATP, ADP и AMP бяха извършени, както е описано по-горе [31–33]. Подробности са дадени в Lindquist et al. [25]. Енергийният заряд се изчислява по следната формула: Енергиен заряд = (ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP).

Анализи на чернодробните ензими.

1 g прясна чернодробна проба се охлажда върху лед и се хомогенизира в 4 ml ледено студена захарозна среда (0,25 М захароза, 10 mM HEPES и 1 mM Na4EDTA, коригирано до рН 7,4 с KOH/HCl). Хомогенатите се центрофугират при 1030 RCF в продължение на 10 минути при 4 ° С и следядрената фракция се отстранява и използва за допълнителен анализ [34]. Окислението на палмитоил-КоА се измерва незабавно в следядрената фракция от пресен черен дроб като киселиноразтворими продукти, както е описано [35]. Допълнителни анализи бяха извършени в замразена следядрена фракция: 3-кетотиолаза (EC: 2.3.1.16) [36], карнитин O-палмитоилтрансфераза 2 (CPT2, EC: 2.3.1.21) [37], цитрат синтаза (EC: 2.3. 3.1) [38, 39], синтаза на мастни киселини (FAS; EC: 2.3.1.85) [40], ацетил-CoA карбоксилаза (EC: 6.4.1.2) [41], цитрат-ATP лиаза (EC: 2.3.3.8) [42], ацил-CoA оксидаза (ACOX; EC: 1.3.3.6) [43], глицерол-3-фосфат ацилтрансфераза (GPAT; EC: 2.3.1.15) [44, 45], ацил-CoA синтетаза (EC: 6.2 .1.3) [46] и малонил-КоА декарбоксилаза (ЕС: 4.1.1.9) [47]. Експресията на протеин на карнитин/ацилкарнитин транслоказа (CACT) беше измерена в замразен черен дроб, хомогенизиран в PBS, като се използва ELISA комплект от Nordic BioSite (Кат .: EKR1588; Täby, Швеция).

Концентрацията на протеин е измерена чрез BioRad протеинов анализ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Анализ на чернодробна генна експресия.

Статистически анализ

Проведена е еднопосочна ANOVA и в случаите със статистическа значимост (p Таблица 1. Тегло и прием на храна при мъжки плъхове Wistar след три седмици лечение.

Ефектът върху плазмения карнитин и карнитиновите производни

В настоящото проучване плазмените нива на L-карнитин (фиг. 1А) и ацетилкарнитин (фиг. 1В) са намалени в групата, хранена с милдронат (съответно 85 и 87% намаление) и при комбинираното лечение с милдронат и 1-тройна TTA (70 и 65% намаление, съответно) в сравнение с контрола. Това беше последвано от 16-кратно повишаване на плазменото ниво на γ-битуробетаин в двете групи, лекувани с милдронат в сравнение с контролите (фиг. 1С), докато иРНК на Bbox1 показа малко, но значително намаление от милдронат + 1-тройно TTA в сравнение с контрол (р = 0,021) и към милдронат (р = 0,003) (Таблица 2). Освен това и в двете експериментални групи плазмените нива на триметилизин (фиг. 1D) и нивата на иРНК на Tmlhe и Aldh9a1 остават постоянни (Таблица 2). Експресията на гена на карнитиновия транспортер OCTN2 (Slc22a5) се индуцира 7-кратно от 1-тройна ТТА при лекувани с милдронат плъхове в сравнение както с контролата, така и с милдроната (Таблица 2). Индуцирана е генната експресия на чернодробна карнитин о-ацетилтрансфераза (Crat)

30 пъти по 1-тройно TTA при лекувани с милдронат плъхове и без промяна на милдронат в сравнение с контрола. Експресията на ген (Таблица 2) и протеин (Фигура 1Е) на CACT (Slc25a20) (Таблица 2) се индуцира от 1-тройна ТТА при лекувани с милдронат плъхове в сравнение с контрола и лечението с милдронат.

A. L-карнитин в плазмата; Б. Плазмен ацетилкарнитин; ° С. Плазмен γ-бутиробетаин; д. Плазмен триметилилизин; Е. Експресия на протеин на карнитин транслоказа (CACT). Стойностите са показани като средна стойност ± SD (n = 6–8). Еднопосочна ANOVA с р 0,05. C – Control, M – Mildronate (550 mg/kg телесно тегло), MT – комбинация от Mildronate (550 mg/kg телесно тегло) и 1-тройна TTA (100 mg/kg телесно тегло).

Ефектът върху окисляването на мастните киселини и митохондриалната функция

(А) Общо β-окисление на палмитоил-КоА в черния дроб; (Б) Общо β-окисление на палмитоил-КоА с добавяне на малонил-КоА в черния дроб; (C) Ензимна активност на ацил-КоА синтетаза; (D) Ензимна активност на карнитин палмитоилтрансфераза (CPT) 2; (Е) Ензимна активност на 3-кетотиолаза; (F) Ензимна активност на малонил-КоА декарбоксилаза (MCD); (G) Ензимна активност на ацил-КоА оксидаза (ACOX); (З) Ензимна активност на цитрат синтаза. Стойностите са показани като средни стойности ± SD (n = 6–8). Еднопосочна ANOVA с р 0,05. C – Control, M – Mildronate (550 mg/kg телесно тегло), MT – комбинация от Mildronate (550 mg/kg телесно тегло) и 1-тройна TTA (100 mg/kg телесно тегло).

(A) Заряд на енергия (ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP). (B) Съотношение на AMP и ATP. Стойностите са показани като средна стойност ± SD (n = 6–8). Еднопосочна ANOVA с р 0,05. C – Control, M – Mildronate (550 mg/kg телесно тегло), MT – комбинация от Mildronate (550 mg/kg телесно тегло) и 1-тройна TTA (100 mg/kg телесно тегло).

Ефектът върху нивото на TAG в черния дроб и липогенезата

(А) Ензимна активност на ацетил-КоА карбоксилаза (ACC). (Б) Ензимна активност на синтазата на мастни киселини (FAS). (C) Ензимна активност на цитрат-АТР лиаза. (D) Ензимна активност на глицерол-3-фосфат трансфераза (GPAT). Стойностите са показани като средна стойност ± SD (n = 6–8). Еднопосочна ANOVA с р 0,05. C – Control, M – Mildronate (550 mg/kg телесно тегло), MT – комбинация от Mildronate (550 mg/kg телесно тегло) и 1-тройна TTA (100 mg/kg телесно тегло).

Ефект върху нивото на TAG в плазмата и експресията на липопротеинов ген

Лечението с милдронат не променя нивото на TAG в плазмата в сравнение с контролите, но трябва да се отбележи, че в комбинацията от Mildronate и 1-тройна TTA, плазменият TAG е значително понижен (Таблица 2). Освен това е настъпила отрицателна корелация между TAG на плазмата и β-окисление на митохондриалната мастна киселина, както и TAG и Dgat2 в плазмата (Таблица 3).

Тъй като промените в скоростта на секреция на VLDL-TAG и скоростта на плазмения клирънс могат да допринесат за ефекта на понижаване на TAG, ние изследвахме дали генната експресия на ApoB, ApoCII, ApoIII и Vldlr (т.е. VLDL рецептор) е променена след 1-тройна TTA. Таблица 2 показва, че комбинацията от милдронат и 1-тройна ТТА понижава нивата на иРНК на ApoB, ApoCII, ApoCIII и Vldlr (p = 0,016, p = 0,021) в сравнение с контрола и милдронат, докато самото приложение на милдронат няма ефект върху тези гени.

Дискусия

Тази работа демонстрира, че въпреки значителното намаляване на плазмения карнитин при плъхове, лекувани с милдронат, 1-тройният TTA успява да понижи концентрациите на TAG в плазмата и черния дроб. Тези подобрения най-вероятно се дължат на повишено окисление на чернодробните мастни киселини в митохондриите, при което карнитинът се консумира ефективно, придружен от намален синтез на TAG и увеличен плазмен клирънс. Тези данни не са свързани с променен прием на храна или наддаване на тегло.

Милдронатът е свързан с намалени плазмени нива на карнитин [49]. В настоящото проучване, Mildronate самостоятелно и в комбинация с 1-тройна TTA намалява плазмените нива на карнитин и ацетилкарнитин в сравнение с контролите, придружени от повишаване на плазмените нива на y-бутиробетаин. Забележително е, че Милдронат не повлиява чернодробната генна експресия на ензимите, участващи в биосинтезата на карнитин. Въпреки това, комбинацията от милдронат и 1-тройна ТТА намалява Bbox1 в сравнение с милдронат и до известна степен контролна група (р = 0,021). По-рано е доказано, че 1-тройното лечение с ТТА при плъхове намалява експресията на Bbox1 и намалява плазмените нива на карнитин и ацетилкарнитин с 40-50%, но също така и γ-бутиробетаин с 40% [25]. Това предполага различни механизми: докато Mildronate намалява нивата на карнитин чрез инхибиране на ензима, участващ в биосинтезата на карнитин [49], 1-тройният TTA може да повлияе на генната експресия на Bbox1 и най-вероятно да увеличи консумацията на карнитин [25]. В присъствието на милдронат, 1-тройният ТТА не показва допълнително намаляване на плазмения карнитин в сравнение с милдронат (71% срещу 85%), но по-голямо намаление от преди това отчетено само при 1-тройно ТТА (52%, Lindquist et al. [ 25]). Следователно, милдронат изглежда е доминирал намаляването на карнитина в комбинираната интервенционна група.

По-рано е показано, че милдронат повишава нивата на TAG в черния дроб, което не е наблюдавано в това проучване. Възможно е да е необходим по-дълъг период на изследване или възрастни плъхове, за да се възпроизведе този ефект, тъй като това проучване е проведено върху плъхове на възраст 5 седмици в продължение на три седмици. Въпреки това, Mildronate се използва за индуциране на затлъстяване на черния дроб при млади плъхове за сходни и по-кратки периоди от време [22, 65]. Дали използването на дневна перорална доза вместо непрекъснато осигуряване на милдронат във фуража е причината за липсата на увеличаване на чернодробната експресия на TAG и OCTN2 гена.

В обобщение, биосинтезата на карнитин е била нарушена от Милдронат, но плазмените нива на карнитин не са били допълнително намалени от 1-тройна ТТА. 1-тройният TTA демонстрира понижаване на TAG в плазмата и черния дроб, въпреки нарушената биосинтеза на карнитин, което показва ефективно използване на карнитин. Ефектът за понижаване на TAG се медиира предимно от повишено окисление на чернодробните мастни киселини, свързано с митохондриална активност, но също така вероятно включващо намален биосинтез на TAG и синтез на липопротеини. Тези открития показват, че 1-тройният ТТА е мощен инструмент за изучаване на липидния метаболизъм и митохондриалната функция и е възможен кандидат за лечение на метаболитни нарушения като мастна чернодробна болест и дефицит на карнитин.

Благодарности

Благодарим на Kari Helland Mortensen и Mari-Ann Jørstad Davidsen за помощта за животните и Randi Sandvik, Kari Williams, Liv-Kristine Øysæd и Svein Krüger за техническата подкрепа. Оценяваме също така незаменимата помощ от главния инженер Торун Ейде, който извърши плазмените анализи на ацилкарнитин. Също така благодарим на JSC Grindeks (Латвия) и Synthetica AS, Осло (Норвегия), че предостави съответно Mildronate и 1-тройна TTA. Тази работа беше финансово подкрепена от Фондация за научни изследвания в Берген и регионалната здравна служба в Западна Норвегия (911945).