Редактирано от Даниел Щайнбърг, Калифорнийски университет в Сан Диего, Ла Хола, Калифорния, и одобрено на 1 юни 1998 г. (получено за преглед на 1 април 1998 г.)

антиатерогенни

Резюме

Предполага се, че антиоксидантите имат антиатерогенен потенциал чрез инхибиране на окисляването на липопротеините с ниска плътност (LDL). Тук докладваме антиоксидант, BO-653 (2,3-дихидро-5-хидрокси-2,2-дипентил-4,6-ди-терт-бутилбензофуран), предназначен да показва антиоксидантна сила, сравнима с тази на α-токоферола, но въпреки това притежават висока степен на липофилност, сравнима с тази на пробукола. BO-653 проявява висок афинитет към LDL и е добре разпределен в аортните съдове in vivo. В моделите на атеросклероза на зайци и мишки е доказано, че BO-653 може да потисне образуването на атеросклеротични лезии без нежелани странични ефекти. По-конкретно, не е имало намаляване на нивата на липопротеините с висока плътност. Този антиоксидант предоставя допълнителни доказателства в подкрепа на хипотезата за оксидирания LDL и сам по себе си е обещаващ кандидат антиоксидант за клинична употреба.

Като признание за описаната по-горе ситуация, ние се заехме да проектираме съединение, което да бъде активно срещу окисляването на LDL в артериалната стена in situ, но не би понижило нивата на HDL. За тази цел внедрихме скринингова стратегия, която доведе до обещаващо антиоксидантно съединение, BO-653. Това съединение е в състояние значително да потисне образуването на атеросклеротични лезии в няколко животински модела без никакво намаляване на HDL. Тези резултати добавят доказателства в подкрепа на хипотезата за оксидирания LDL и предполагат, че това съединение е обещаващ антиоксидант за клинична употреба.

Дизайн на лекарства.

Дизайнът на този антиатерогенен антиоксидант е насочен към преодоляване на някои слаби места на наличните антиоксиданти. Искахме уникална комбинация от характеристики: (i) висока реактивност срещу окисляване на липопротеини и (ii) локализация вътре в хидрофобното ядро ​​на LDL частицата. Високата реактивност е проектирана рационално чрез понижаване на енергията на дисоциация на фенолната O-H връзка, т.е. кислородният атом, разположен пара до фенолната хидроксилна група, може да стабилизира феноксилния радикал мощно, когато принадлежи към 5-членен пръстен, както е описано от Ingold et al. (17). По този начин ние проектирахме хидроксибензофуранова структура, за да постигнем предишните характеристики. Пробуколът е добре известен с последната характеристика (18) и се отличава в това отношение от антиоксидант като α-токоферол, който е в състояние да взаимодейства само с повърхностните липиди на LDL (19). В допълнение, ние търсихме съединение, което да: (iii) не показва странични ефекти, като намаляване на HDL (8, 20) и (iv) показва ефективно усвояване и доставяне до артериалната стена, решаващо място за LDL окисляване.

Стратегия за скрининг.

От библиотека от 600 новосинтезирани антиоксиданти, съгласно критериите, споменати по-горе, проверихме за (i) инхибиране на разграждането на макрофагите на окислени LDL след инкубация с метални йони в присъствието на различни съединения, (ii) вариантно действие на окислителните инициатори в системи за LDL окисление, (iii) реактивност с пероксилни радикали след подбор за първите два критерия и (iv) абсорбционни и разпределителни свойства след перорално приложение при зайци Watanabe наследствени хиперлипидемични (WHHL).

МЕТОДИ

Експериментални животни.

Мъжките WHHL зайци, на възраст 2-3 месеца, са закупени от Kitayama Labes (Ina, Япония). Женски мишки C57BL/6J на възраст 5 седмици са закупени от Clea Japan (Токио, Япония). Мъжки и женски LDL-рецепторни нокаутиращи мишки на 6 седмици и JW зайци на 3 месеца са получени от CSK Research Park (Токио, Япония). Женски ICR мишки са закупени от Charles River Japan (Atsugi, Япония) за перитонеални макрофаги. Перитонеалните макрофаги са получени по метода на Адамс (21), като се използва тиогликолатова среда на Brewer’s (Difco). Зайци и мишки бяха настанени в стаи за животни поне 1 седмица преди експериментите, със свободен достъп до храна и вода. Животните са били третирани в съответствие с етичните насоки на Chugai Pharmaceutical за грижи за животни, работа и прекратяване. Тези насоки отговарят на общоприетите международни критерии за хуманно отношение, като щадят животните от ненужна болка и страдание и гарантират, че проведените експерименти са от реална научна полза за човечеството.

Анализ на хемилуминесценция.

Пероксилните радикали на линолова киселина се генерират чрез автоксидация и се откриват чрез хемилуминесценция, като се използва аналог на Cypridina luciferin [2-метил-6- (р-метоксифенил) -3,7-дихидроимидазо [1,2-a] пиразин-3-он (MCLA) ] (22). Разтвор на 1 mM линолова киселина в 1-бутанол, съдържащ 10 μM MCLA, се инкубира в продължение на 10 минути при 37 ° С под въздух. Хемилуминесценцията се предизвиква от бързата реакция на MCLA с синглетен кислород, генериран от пероксилни радикали на линолова киселина. Угасяването на хемилуминесценцията се оценява като промяна в интензивността на хемилуминесценцията след добавяне на съединението.

Окисление на LDL.

LDL (плътност 1,019–1,063 g/ml) се изолира чрез последователно ултрацентрифугиране от заешка плазма (23). LDL (200 μg/ml) и тестваното съединение се инкубират при 37 ° С в продължение на 24 часа с 10 μM CuSO4 или 40 μg/ml соева липоксигеназа. Липидните пероксиди бяха определени като реагиращи на тиобарбитурова киселина вещества (TBARS) (22). За тестовете за разграждане LDL е белязан с Na 125 I, като се използва процедурата с йоден монохлорид (24). 125 I-LDL се инкубира при 37 ° С в продължение на 24 часа с 10 μM CuSO4 и разграждането се извършва чрез инкубиране на перитонеални макрофаги на мишка в среда RPMI 1640, съдържаща 10 μg/ml LDL при 37 ° С в продължение на 5 часа, след което определя се разтворима нейодидна радиоактивност на трихлороцетна киселина.

Диети и администриране на съединения.

Диетата с високо съдържание на мазнини (1,25% холестерол) е приготвена съгласно Nishina et al (25). Диетите, използвани в тази статия, са направени от Clea Japan и посочената концентрация на съединението в диетата е потвърдена чрез HPLC, както е описано по-долу. C57BL/6J мишки се поддържат в продължение на 28 седмици на диета с високо съдържание на мазнини, съдържаща 0,5% от тестваното съединение или целулоза; LDL-рецепторните нокаутиращи мишки се поддържат в продължение на 13 седмици или 21 седмици на диета. WHHL зайци се поддържат в продължение на 6 месеца на нормална диета (CR3) без добавени антиоксиданти или с 1% пробукол или 0,2% или 0,5% BO-653.

Измерване на липопротеинов профил и концентрация на съединението.

Профилите на плазмените липопротеини се оценяват като концентрации на фракции на холестерол чрез гел-проникваща хроматография (GPC). Десет микролитра кръв бяха получени от дорзалната метатарзална вена и бързо бяха разредени във физиологичен разтвор. След това разредената плазмена проба се получава чрез центрофугиране и се анализира чрез GPC за липопротеинов профил и чрез автоанализатор (COBAS FARAII, Hoffmann-La Roche) за липиден състав. Концентрациите в диети, плазма и тъкани се определят чрез обратнофазова HPLC на метанол-разтворимата фракция на диетични, плазмени и тъканни хомогенатни проби.

Оценка на атеросклеротични лезии и оценка на ксантома.

Зоната на атеросклеротична лезия на зайци WHHL беше оценена като площ на мастната област на вътрешните повърхности на аортата. Замразените напречни сечения на аортните клапани или аортните дъги бяха оцветени със Судан IV и оцветени с хематоксилин. Атеросклеротичните лезии се оценяват като средна площ на Судан IV-позитивни области в напречните сечения на аортната клапа (26) или аортните сечения (четири секции с дебелина 6 mm на интервали от 1 mm). Всички области бяха определени със софтуера SigmaScan Pro (Jandel Scientific Software), сканиран върху снимките на вътрешната повърхност на аортата, аортната клапа или аортната дъга. Ксантомите, наблюдавани главно в предните крайници и клепачите, се оценяват чрез точкуване. Резултатът за ксантома се изчислява като сума от двете оценки на предните крайници (0 = няма лезии, 1 = леко подуване, 2 = тежко подуване) и оценка на клепачите (0 = няма лезии, 1 = лезии).

Статистически анализ.

Статистическата значимост спрямо контролната група беше анализирана по метода на Dunnett на ANOVA.

РЕЗУЛТАТИ

In vitro ефекти.

BO-653 е избран като оптимално съединение, тъй като притежава следните структурни характеристики (фиг. 1а): (i) бензофуранова структура с мощна активност като донор на водород; (ii) ди-терт-бутилова структура, заобикаляща антиоксидантно функционално място, като по този начин може да упражнява въздействие върху окисляването дори в хидрофобното ядро; и (iii) странични вериги, способни да модулират мобилността и хидрофобността, повишавайки абсорбцията и разпределението и позволявайки изключването на стереоизомери.

Свойства на антиоксиданта BO-653. (а) Структура на BO-653, 2,3-дихидро-5-хидрокси-2,2-дипентил-4,6-ди-терт-бутилбензофуран и структурите на антиоксидантите пробукол и а-токоферол. (b) Инхибиране на BO-653 върху хемилуминесценцията, индуцирана от пероксилни радикали на линолова киселина. Пероксилните радикали на линолова киселина се генерират чрез автоксидация и се откриват чрез хемилуминесценция, използвайки MCLA. (c) Инхибиране на BO-653 върху заешко окисление LDL. LDL и тестваното съединение се инкубират при 37 ° С в продължение на 24 часа с CuSO4 или соева липоксигеназа (LO) и липидните пероксиди се определят като TBARS. (d) Инхибиране чрез BO-653 на 125 I-LDL разграждане, предизвикано от окисление. 125 I-LDL се инкубира при 37 ° С в продължение на 24 часа с CuSO4 и разграждането се извършва чрез инкубация с миши перитонеални макрофаги. Всички резултати са показани като средно ± SD на трикратни (b и c) или дублирани (d) проби. ∗, P 2+ или липоксигеназа, при която се установи, че анализът BO-653 е по-мощен от пробукола или а-токоферола, особено срещу окисляването на липоксигеназата (фиг. 1в). BO-653 също инхибира разграждането на LDL от макрофагите 3 пъти по-силно, отколкото пробуколът (фиг. 1г). Взети заедно, тези резултати показват, че BO-653 мощно инхибира LDL окисляването.

Антиатерогенен ефект.

Плазмен холестерол, VLDL + LDL и HDL нива и LDL окисляване при WHHL зайци