•  

Международно списание за приложна биология и фармацевтични технологии

micrantha

Меню на дневника

Абстрахиране и индексиране

Антихолинестеразни свойства на Mareya Micrantha (Benth) Mull. Арг. (Euphorbiaceae) и неговите фракции върху холинестеразния модел на изолиран заешки дванадесетопръстник

Информация за статия

Dosso 1 *, T.Y. Соро 2, М. А. Везни 1, Ф. Траоре 2, Дж. Д. Н’гуесан 3

1 Катедра по биохимия-генетика, UFR биологични науки, Университет Peleforo Gon Coulibaly, B.P 1328 Korhogo, Кот д'Ивоар

2 Лаборатория по физиология на животните, UFR Biosciences, Félix Houphouët-Boigny University, 22 B.P. 582 Абиджан22, Кот д'Ивоар

3 Лабораторна фармакодинамична биохимия, Катедра по биологични науки, Университет Феликс Уфу-Боани, 22 BP 582 Abidjan 22, Кот д'Ивоар

*Автора за кореспонденция: Мамаду Досо, Катедра по биохимия-генетика, UFR биологични науки, Университет Peleforo Gon Coulibaly, B.P 1328 Korhogo, Кот д'Ивоар

Получено: 20 май 2020 г .; Прието: 01 юни 2020 г .; Публикувано: 05 юни 2020

Цитат: Mamadou Dosso, Tianga Yaya Soro, Michel Archange Libra, Flavien Traore, Jean David N’guessan. Антихолинестеразни свойства на Mareya Micrantha (Benth) Mull. Арг. (Euphorbiaceae) и неговите фракции върху холинестеразния модел на изолиран заешки дванадесетопръстник. Международно списание за приложна биология и фармацевтични технологии 11 (2020): 121-130.

Резюме

Резюме

Изследването на антихолинестеразните свойства на Mareya micrantha, растение, използвано в африканската фармакопея като слабително, беше проведено върху холинестерази на заешкия дванадесетопръстник. При 0,15 mg/ml водният екстракт (MAR), неговата фракция (F5) и неговата субфракция (F52), в зависимост от състоянието им на чистота, намаляват каталитичната скорост на холинестеразите по време на хидролизата на ацетилтиохолина (ASCh), без да повлияе значително на константата на Михаелис. Подфракцията (F52) с най-добрите антихолинестеразни и миостимулиращи ефекти, разкрити от биологичното проучване, е с 25% по-ефективна от MAR. Изследване на високоефективната течна хроматография (HPLC) хроматограма на тази подфракция F52 показва, че това растение е богато на фенолни молекули.

Ключови думи

Слабително; Марея мирант; Фракция; Холинестерази; HPLC

Подробности за статията

Въведение

Материали и методи

Растителен материал

Пресните листа на Mareya micrantha бяха събрани в местността Akoupé през юни 2007 г., идентифицирани и удостоверени от Pr Ake Assi Laurent от катедрата по ботаника на университета Félix Houphouët-Boigny (Кот д'Ивоар). След идентифициране, един екземпляр е депозиран под номер 1804 в хербария на Националния флористичен център на университета Феликс Уфу-Боани.

Животински материал

За нашите фармакологични и ензимни експерименти използвахме зайци от вида Oryctolagus cuniculus (Leporidae), от община Абобо (Абиджан, Кот д'Ивоар). Те тежаха средно 2 kg и бяха аклиматизирани при околни условия (28 ° ± 3 ° C) в продължение на една седмица в дома за животни на Отдела за обучение и изследване на биологичните науки (UFR) на Университета на Félix Houphouët-Boigny в Кокоди. Фотопериодът е 12/24 часа.

Експериментално устройство

Експерименталното устройство се състои от термостатично контролирана водна баня, изолиран резервоар за органи, напълнен с физиологичен разтвор от типа Mac Ewen, съдържащ се в колби, поставени на 40 см от апарата. Течностите, съдържащи се във флаконите, се поставят в поливинилови катетри и след това намотки, които позволяват на тези разтвори да се затоплят до температура от 38 ° C. Това подаване на течност се контролира от многопосочен селективен клапан. Изолираният съд за органи може да се източи през дренаж в долната част на устройството.

Методи

Метод за приготвяне на воден екстракт от Mareya micrantha

Листата на Mareya micrantha бяха изсушени на въздух и след това натрошени. Осемдесет грама сух прах се смесват с два литра дестилирана вода. Сместа се разклаща в продължение на 24 часа при стайна температура с помощта на бъркалка (AGIMATIC-N). Мацерираната смес се филтрира през памучна вата. Филтратът се изпарява с помощта на ротационен изпарител Buchi при 70 ° С. След пълно изпаряване се получава прах, част от който се използва като воден екстракт (MAR), а другата част се фракционира.

Метод за разделяне на фракциониране на воден екстракт

Водният екстракт от Mareya micrantha (1,5 g) се разтваря в един литър 70% етанол (етанол/вода; 70/30; v/v). Сместа се разбърква в продължение на 6 часа и се оставя да престои в разделителна колба за 24 часа. Бяха получени хидроалкохолен супернатант (F1) и утайка (P), събрани отделно и след това изпарени с помощта на ротационен изпарител Buchi при 60 ° C. Получените гранули се сушат във фурна при 50 ° C. Част от F1, поета със смес циклохексан-вода (5: 5; v/v), се подлага на същия процес. Получават се циклохексанова фракция (F2) и водна фракция (F3). Екстрактът, получен от водната фаза (F3), се поема в смес етилацетат-вода (5: 5; v/v). Разтворът се подлага на същата обработка като другите смеси. Получават се етилацетатна фракция (F4) и водна фракция (F5). F5 със сила от 1371,42 mg, разкрита от биологичното проучване, представя най-добрия миостимулиращ ефект. Следователно той ще бъде запазен за фракциониране в твърдо течно състояние.

Метод за твърдо течно фракциониране върху гел Sephadex G25 от F5

800 mg фракция F5, разтворена в 10 ml дестилирана вода, се прекарва върху колона (50 cm x 1,5 cm) гел Sephadex G25 с дестилирана вода като подвижна фаза. Скоростта на елуиране се коригира до 2 ml на минута. Обемите от 10 ml бяха събрани и след това групирани въз основа на техния ccm профил в три подфракции F51, F52 и F53. Тези фракции се изпаряват при понижено налягане с помощта на ротационен изпарител BÜCHI 461 с водна баня. Получените прахове са използвани за физиологични тестове и F52 с най-добър положителен инотропен ефект се анализира с помощта на препаративен апарат RP-HPLC (C18).

Метод за приготвяне на ензимен екстракт

Методът за приготвяне на ензимния екстракт се основава на този на Khoa и Ochillo (1987) (Khoa et al., 1987), възприет от Bahi (1998). След 24-часово гладуване заекът е зашеметен от удар с тояга по врата и бързо кърви през сънната артерия. След лапаротомия на средната линия, четири грама черва (дванадесетопръстника) незабавно се отстраняват и се потапят в 0,5 М моно и ди-натриев фосфатен буфер, рН 7,8, и след това се смачкват с Т 25 микро-мелница при 2500 об/мин за 2 минути. След това полученото смилане се центрофугира при 2500 об/мин за половин час в центрофуга Alresa. Получената супернатанта представлява ензимния препарат.

Метод за приготвяне на реагента на Ellman за ензимни анализи

Изследването на общата холинестеразна активност се извършва със субстратния реагент на Ellman, ацетилтиохолин (ASCh) при 0,014 М концентрация, приготвен с 0,4 g ацетилтиохолин йодид, разтворен в 100 ml фосфатен буфер. Реактивът на Ellman се приготвя едновременно със смес от 100 µL 0,014 М ацетилтиохолин йодид, 100 µL 0,01 M DTNB (дитиобиснитробензоат) (получен чрез разтваряне на 0,4 g DTNB в 100 ml 0,5 M фосфатен буфер, рН 7,8) и 800 µL от 0,5 М фосфатен буфер, рН 7,8.

Метод за изследване на активността на заешки дванадесетопръстник холинестерази в присъствието и отсъствието на ефектора

За изследване на активността на холинестеразата, към реакционната среда се добавят 100 µL реагент на Ellman с нарастващи концентрации на ацетилтиохолин (10 -5 М до 10 -2 М). Тази среда се състои от 1 ml фосфатен буфер (0,5 М, рН 7,8) и 50 µL ензимен разтвор, предварително инкубирани при 38 ° С за 5 минути. По време на 10-минутна инкубация холинестеразите в присъствието или отсъствието на 30 µL ефектор при 0,15 mg/ml хидролизират ацетилтиохолин (с различни концентрации) от реагента на Ellman. Продуктите на хидролизата са ацетат и тиохолин, който реагира с DTNB, за да се получи жълто оцветяване, чиято интензивност се измерва чрез спектрофотометър при 412 nm спрямо контрола, която не съдържа ензимен разтвор. Промяната в оптичната плътност (OD) спрямо контролата, измерена и начертана спрямо времето на инкубация (dA/min), представлява първоначалната скорост. Представянето LINERWEAVER-BURK (1/V като функция от 1/S) се изгражда от тези стойности и се използва за определяне на Vmax и KM.

Метод за отстраняване и поставяне на изолирания орган

Заекът, който е постил 24 часа, е нокаутиран. След лапаротомия по средната линия, сегментите на дванадесетопръстника с дължина 3 cm незабавно се отстраняват и се поддържат живи в разтвор на глюкоза и кислород Mac Ewen. Един от фрагментите е монтиран на записващия апарат в кладенец, съдържащ 250 ml Mac Ewen в (mM) Nacl 130; Kcl 2,5; Cacl2 2,40; NaH2PO3 1,18; NaHC03 11,90; MgCl2 0,24; глюкоза 2,2 с рН 7,4 непрекъснато кислород и температура 38 ° C.

С помощта на жица, преминала през стената на дванадесетопръстника, в единия край на дванадесетопръстника се прави възел, който позволява да се закачи във вътрешността на изолирания орган. Другият край е свързан с друг проводник към стилуса, чийто връх е в контакт с хартия, покрита с черен дим, навита върху цилиндър, подложен на въртене с постоянна скорост.

Експериментален протокол

С помощта на градуирана спринцовка, обемът на разрежданията, направени от тестваните вещества, се въвежда в едноорганен съд, кладенче, съдържащо 250 ml Mac Ewen. За да преминете от един тест към следващия, препаратът се измива старателно с Mac Ewen (750 ml), за да се избегне кумулативният ефект на изпитваните вещества.

Метод за анализ на фенолните съставки на подфракцията F52

За анализ на фенолните съставки на фракцията F52, използвахме варианта RP-HPLC (C-18) апарат, оборудван с PDA (фотодиоден масив) детектор. Обемът на инжектиране е 20µl, температурата на анализа е 25 ° C, а дебитът на помпата е 1mL/mn. Подвижните фази, използвани по време на този анализ, са: вода с 0,1% TFA за елуент A и ацетонитрил за елуент B. Различните градиенти, използвани за анализа, са: мобилна фаза [T = 0: 95% (A), 5% (B) ]; [T = 10: 85% (A), 15% (B)]; [T = 45 70% (A), 30% (B)]; [T = 50: 0% (A), 100% (B)]; [T = 55: 0% (A), 100% (B)].

Статистически анализ

Статистическите данни, изразени като средна стойност ± стандартна грешка (M ± SEM), са получени от (n = 4) отделни експерименти. Изчислените средни стойности са сравнени от теста на Student (t). Когато p ≤ 0,05, разликата се казва значителна. Кривите и статистическият анализ бяха извършени с помощта на Graph Pad Prism 5.01, Сан Диего, Калифорния, САЩ.

Резултати

Влияние на MAR върху общата холинестеразна активност на заешки дванадесетопръстник

Фигура 1. показва ефекта на MAR при 0,15 mg/ml върху каталитичната активност на общите холинестерази в заешкия дванадесетопръстник. В присъствието на MAR максималните стойности на скоростта и постоянството на афинитет са 83,3 µM/min (P 1 µM/mn)