Ма. Великденска радост Саджо

1 Катедра по медицинска биология на околната среда, Медицински колеж Wonju, Университет Yonsei, Wonju, Gangwon 220-701, Република Корея

ефекти

Чеол-Су Ким

2 Катедра по микробиология, Медицински колеж Wonju, Университет Yonsei, Wonju, Gangwon 26426, Република Корея

Су Ки Ким

2 Катедра по микробиология, Медицински колеж Wonju, Университет Yonsei, Wonju, Gangwon 26426, Република Корея

Куанг Йонг Шим

3 Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Wonju, Университет Yonsei, Wonju, Gangwon 26426, Република Корея

Tae-Young Kang

4 Катедра по ревматология, Медицински колеж Wonju, Университет Yonsei, Wonju, Gangwon 26426, Република Корея

Kyu-Jae Lee

1 Катедра по медицинска биология на околната среда, Медицински колеж Wonju, Университет Yonsei, Wonju, Gangwon 220-701, Република Корея

5 Институт за намаляване на бедността и международно развитие (IPAID), Университет Йонсей, кампус Уонджу, Уонджу, Гангвон 220-710, Република Корея

Резюме

1. Въведение

В това проучване изследвахме терапевтичните in vivo ефекти на шунгита срещу UVB-индуцирано увреждане на кожата, сравнявайки антиоксидантната сила на богат на минерали шунгит и без минерали шунгит с предлагания в продажба фулерен C60. Предполагаме, че шунгитът може да има възможни антиоксидантни и противовъзпалителни ефекти срещу индуцирано от ултравиолетови B- (UVB-) увреждане на кожата при обезкосмени мишки. За да проверим тази хипотеза, ние изследвахме физиологичните кожни параметри, имунно-редокс профилирането и свързаното с оксидативен стрес сигнализиране на богати на минерали и без минерали третирани без шунгит мишки.

2. Материали и методи

2.1. Мишки

Осемседмични мъжки обезкосмени мишки са получени от Orient Bio Inc. (Seongnam, Република Корея) и са поддържани при 22 ± 2 ° C и 40–60% влажност при цикъл от 12: 12 часа светло тъмно. Мишките се аклиматизират за една седмица и се разпределят на случаен принцип в шест групи: не-UVB-облъчената нормална контролна група (NC) и петте UVB-облъчени групи: няма обработена група (UV), обработена с фулерен група (PC), група, третирана със зехтин (OIL), богата на минерали група, обработена с шунгит (MRS), и група, обработена с минерали без шунгит (MLS). Около 200 μL от лечебните съединения (200 μg/ml) се прилагат локално, като се използват ръцете с ръкавици, прилагащи еднакъв натиск през цялата гръбна страна на мишката. В края на експеримента мишките бяха евтаназирани чрез инхалационни анестетици, CO2 газ в продължение на 20 секунди и след това мишките бяха обезглавени. Употребата на животни и протоколът за този експеримент са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC), Университет Йонсей, град Вонджу (YWC-151113-1).

2.2. UVB експозиция

Експерименталните мишки бяха поставени в пластмасова клетка и бяха облъчени с помощта на TL 40 W/12RS Philips, нефилтрирани флуоресцентни слънчеви лампи (Амстердам, Холандия), излъчващи лъчи от 290–320 nm. Разстоянието от лампите до гръбната повърхност на кожата на мишките беше 20 cm. Интензитетът на UVB лампата е 0.75 ± 0.10 mW/cm 2, като се използва YK-34 UV, UV светломер от Lutron Electronics Inc. (Тайпе, Тайван), а общата кумулативна доза на облъчена UVB енергия е 2700 mJ/cm 2. Мишките бяха облъчени в продължение на 15 минути в 2 последователни дни.

2.3. Приготвяне на химическа и шунгитова суспензия

Произведеният buckminsterfullerene C60 е закупен от Vaughter Wellness (Лондон, Обединеното кралство) с чистота 99,8%. Богатият на минерали шунгит се третира с KOH като алкална обработка с висока температура. Минералният шунгит е третиран с HNO3 и високотемпературен (3000 ° C) третиране на богат на минерали шунгит. Тези смеси се обработват с ултразвук с помощта на вихър и соникатор, докато всички разтвори се смесят енергично.

2.4. Характеризиране на шунгит без минерали

Съставът и визуализацията на шунгит с минерали не са анализирани чрез енергийно-дисперсионна рентгенова (EDX) спектроскопия. Съставът на минералните проценти включва 86,43% въглерод, 0,18% натрий, 1,33% магнезий, 3,17% силиций, 1,09% сяра, 0,22% хлор, 0,95% калий, 5,33% калций, 1,06% желязо и 0,2% мед.

2.5. Физиологичен анализ на кожната повърхност

Състоянието на кожата на мишките беше оценено преди и след 7-дневно лечение с устройство за диагностика на кожата, Aramo TS Device (Seongnam, Република Корея). Устройството е цялостна система за неинвазивен, оптичен анализ на няколко безразмерни параметъра на кожата: влага, еластичност, порьозност на себума, гладкост (равномерност), обезцветяване (пигментация) и бръчки. Измерванията бяха направени в много специфични точки, разположени от дорзалната страна на мишките, а резултатите бяха разликата преди и след лечението, за да се оцени подобрението.

2.6. Имунен профил

2.6.1. Бели кръвни клетки (WBC) и неговият анализ на диференциалния брой

Кръв се събира от ретро-орбиталния сплит в епруветки, покрити с антикоагулант и се смесва с автоматичен миксер в продължение на 5 минути. След това WBC и неговите диференциални членове като лимфоцити, моноцити, неутрофил, еозинофил и базофил бяха измерени с помощта на автоматичен анализатор на кръв от HEMAVET HV950 FS, Drew Scientific Inc. (Тексас, САЩ).

2.6.2. Възпалителни цитокини на серума и кожата лизат

Възпалителни цитокини на серумен и кожен лизат, включително IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IL-KC и TNF-α, са анализирани с помощта на Bio-Plex Cytokine Assay от Bio-Rad (Калифорния, САЩ) според инструкциите на производителя. Стандартните криви за всеки адипокин и цитокин бяха генерирани чрез използване на референтните концентрации, предоставени в комплектите. Средната интензивност на флуоресценция е получена по технология Luminex от системата Bio-Plex 200 на Bio-Plex 200 Multiplex Bead Array System ™ (Калифорния, САЩ) и е анализирана със съответния софтуер с помощта на 5-параметър логистичен метод.

2.7. Редокс профил

2.7.1. Откриване на вътреклетъчни реактивни кислородни видове (ROS)

Комплектът за откриване на ROS/RNS от Enzo Life Sciences Inc. (Ню Йорк, САЩ) е използван съгласно инструкциите на производителя за определяне на ефектите на шунгитовите съединения върху оксидативния стрес и супероксида в серума и кожните лизати. Двадесет и пет (25) μL проба се зарежда и разтвор за откриване се добавя към всяка ямка. Плочата е разчетена в многомодовия четец за микроплаки DTX-800 от Beckman Counter Inc. (Калифорния, САЩ), използвайки набор от филтри с възбуждане 485/20 и излъчване 528/20 за откриване на окислителни видове.

2.7.2. НЕ Анализ

Нитритът (NO2 -), присъстващ в кръвния серум и кожните лизати на мишки, е открит с помощта на реагента на Griess от Promega Corp. (Madison, САЩ). Накратко, 50 μL от серума се смесва с еднакъв обем реактив на Griess в 96-ямкова микротитърна плака и се инкубира при стайна температура в продължение на 15 минути. Абсорбцията се отчита при 540 nm, като се използва мултимодов четец за микроплаки DTX-880 от Beckman Counter Inc. (Калифорния, САЩ). Концентрацията на NO2 е изчислена чрез сравнение с представителната стандартна крива на NO2, генерирана от серийни двукратни разреждания на натриев нитрат.

2.7.3. Антиоксидантни ендогенни ензимни дейности

Активността на супероксиддисмутаза (SOD), глутатион пероксидаза (GPx) и миелопероксидаза (MPO) в серумни и кожни лизати се измерва с помощта на комплекта Biovision (Калифорния, САЩ). Суровият кожен лизат се центрофугира при 14 000 rpm в продължение на 15 минути. при 4 ° С и отломките бяха изхвърлени. След това кожният лизат беше проверен за концентрация на протеин с помощта на Pierce ™ BCA Protein Assay Kit от Thermo Scientific (Илинойс, САЩ). И накрая, нормализираните концентрации на клетъчни лизати бяха използвани за измерване на активността на различни антиоксидантни ензими (SOD, GPx и MPO) в съответствие с инструкциите на производителя.

2.8. Анализ на Western Blot

Накратко, приготвеният кожен лизат с нормализирана концентрация на протеин беше равномерно натоварен и разделен чрез електрофореза върху SDS-полиакриламидни гелове. Десет (10) процента разделящ гел и 5% гел за подреждане се приготвят със следните компоненти. 10% отделящ гел (10 ml) се състои от 4,0 ml dH2O, 3,3 ml 30% акриламидна смес, 2,5 ml 1,5 M Tris (рН 8,8), 100 μL 10% SDS, 100 μL 10% APS и 4 μL TEMED. 4% гел за подреждане (5 ml) се състои от 2,7 ml dH2O, 670 μL 30% акриламидна смес, 500 μL 1,0 M Tris (рН 6,8), 40 μL 10% SDS, 40 μL 10% APS и 4 μL TEMED. 15 μL

20 μL от пробата с буфер за зареждане на проба с оптимизирана концентрация се зарежда в гела. След това, той ще бъде пуснат в 30 mA, 70–80 v. PVDF мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено обезмаслено мляко при стайна температура в продължение на 2 часа и бяха инкубирани със следните първични антитела: фосфо-JNK и фосфо-р38, ERK, Nrf2 и β-актин (разреждане: 1: 2000; Cell Signaling Technology, Масачузетс, САЩ) в Tris-буфериран физиологичен разтвор/tween 20 (1X TBST), съдържащ 5% говежди серумен албумин за една нощ при 4 ° C. Използваното вторично антитяло е анти-заешко (разреждане: 1: 2000; Технология за клетъчна сигнализация) и след това се инкубира при стайна температура в продължение на 2 часа. Специфични протеинови ленти бяха визуализирани чрез засилената хемилуминесценция (ECL Pierce Biotechnology), използвайки UVP Biospectrum 600 Imaging System (UVP, LLC, Upland, CA, USA). β-актин (разреждане: 1: 2000, клетъчна сигнална технология) е използван като контролни натоварвания за общото съдържание на протеин.

2.9. Управление и анализ на данни

Статистическият анализ беше извършен с помощта на дисперсионен анализ (ANOVA), последван от последващ тест за многократно сравнение (тест за множество сравнения на Dunnett), използвайки софтуерни пакети GraphPad Prism версия 7.0 (Калифорния, САЩ). Разликите се считат за значими при ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗∗∗∗ p Фигура 1). Освен това грапавостта, пигментацията и бръчките бяха значително намалени и показаха подобрение след 7 дни локално приложение на шунгит. Размерът на порите на групите MRS и MLS не показва значително намаляване, но се подобрява в сравнение с компютъра. Тези резултати показват клинични доказателства за антиоксидантните и противовъзпалителни ефекти на MRS и MLS във външната повърхност на кожата.