Субекти

Авторска корекция на тази статия е публикувана на 23 май 2019 г.

Тази статия е актуализирана

Резюме

Въведение

Взаимоотношенията между фитофаговите насекоми и техните паразитни/мутуалистични микроби отдавна са изследвани, за да се разбере тяхната еволюционна диверсификация. В един случай местните факултативни или облигативни мутуалистични микроби са свързани с няколко вида семейства фитофаги, включително семейства за хранене на растения Chrysomelidae (Coleoptera), Curculionidae (Coleoptera), растения, жлъчни Cecidomyiidae (Diptera) и всички хемиптерани за хранене на растения семейства 16. Симбиотичните микроорганизми в термитите осигуряват основни екосистемни функции чрез смилане на целулозни материали (дърво, постеля и хумус), за да насърчат образуването на почвата и циркулацията на хранителни вещества 10. Смята се, че бактериалните ендосимбионти са полезни за насекомите чрез осигуряване на незаменими аминокиселини и витамини, рециклиране на източници на въглерод и защита срещу врагове 17. Въпреки че гъбичните мутуализми не са толкова разпространени във фитофаговите насекоми в сравнение с бактериалните мутуализми 18,19, те играят важна роля в развитието на насекомите и пригодността им, като осигуряват азотни съединения, разграждат молекули с високо молекулно тегло и произвеждат феромони за чифтосване и комуникация 20 .

Напоследък използването на високопроизводителни технологии за секвениране от следващо поколение даде по-добро и всеобхватно разбиране за чревните микробиоти на насекоми. Тази техника може да открие значително по-голямо разнообразие в микробни популации в сравнение с традиционните културни и конвенционални молекулярни методи 6. С помощта на високопроизводителни технологии за секвениране са проведени специфични проучвания върху бактериални и гъбични съобщества за много насекоми, включително термити, мравки, огнени бъгове, плодови мухи, бръмбари и пчели, но рядко за насекоми Buprestidae 21,22,23,24,25, 26,27. Едно от малкото проучвания, които правят това, характеризира червата на микробните общности на Agrilus planipennis чрез 16S rRNA генно-базиран анализ на профилиране на клонинги в библиотека, който предполага, че инвазивното насекомо съдържа разнообразни, динамични и вероятно многофункционални микробни общности, които трябва да се разглеждат като многовидови комплекси 28. Друго проучване на тъканно специфична генна експресия в A. planipennis демонстрира, че голям брой последователности на средното черво кодират свързващи хитин домени на перитрофин и трипсин, докато последователностите, получени от мастни тела, кодират голям брой домейни на цитохром Р450 и протеин киназа 29 .

В това проучване са изследвани бактериалните и гъбични съобщества в A. Мали подробно чрез последователността на Illumina MiSeq. По-конкретно, ние разгледахме следните цели: 1) разкриване на динамичните промени в бактериалните и гъбични съобщества в хода на етапите на развитие на A. Мали от естествени местообитания; 2) характеризиране на разнообразието на бактериални и гъбични общности при възрастни A. Мали хранени с две различни диети; и 3) проучване на разпределението и сглобяването на ядрото A. Мали чревна микробиота.

Резултати

Разпределение на таксони и филотипове

Микробно алфа и бета разнообразие в червата на A. mali

Индексите на микробното алфа разнообразие, включително богатството на OTU (т.е. богатство) и индекса на Shannon-Wiener (т.е. Shannon) бяха оценени в червата на A. Мали по време на три етапа на развитие и за насекоми, хранени с две различни диети (фиг. 1A – D). През различните етапи на развитие микробното алфа разнообразие показва тенденция първо да се увеличава, а след това намалява. Групата Pup показа най-високото богатство на OTU и индекса на Shannon-Wiener както за бактериални, така и за гъбични съобщества. За бактериалните съобщества индексите на алфа разнообразие са най-ниски в групата на EcA, докато за гъбичните съобщества богатството на OTU и индексът на Shannon-Wiener са най-ниски съответно в групите Lar и EcA. Имайки предвид ефекта от различните диети, групата MpuA (възрастни хранени М. пумила листа) показаха по-висок бактериален индекс на Шанън-Винер от този на групата MhaA (възрастни, хранени М. халяна листа), а бактериалното богатство на OTU се различава малко между двете чревни микробиоти. За разлика от тях, гъбичното богатство на OTU е по-високо в групата MpuA, отколкото наблюдаваното в групата MhaA, докато индексът на Shannon-Wiener се различава малко между двете чревни микробиоти.

бактериални

Модели на микробно разнообразие за A. Мали чревни микробиоти. Алфа-разнообразие в бактерията (A,° С) и гъбични (Б.,д) чревни общности на A. Мали червата. Бета-разнообразие в бактерията (Е.) и гъбични (F) чревни общности, оценени чрез анализ на главния координат (PCoA) въз основа на разстоянието на Брей-Къртис.

Основният координатен анализ (PCoA), базиран на разстоянието на Bray-Curtis (Фиг. 1E, F), показва различни резултати между бактериалните и гъбични съобщества на чревната микробиота в A. Мали. За бактериалната общност микробиотата варира последователно през етапите на развитие, където групите MpuA и EcA се групират заедно от групата MhaA. За гъбичната общност през различните A. Мали етапите на развитие, групите Pup и Lar се групираха заедно и бяха отделени от групата EcA. За разлика от това при лечението на A. Мали с различни диети, групите MpuA и MhaA се групираха заедно и бяха отделени от групата EcA.

Динамични модели на чревния микроб по време на развитието на A. mali

Динамични модели на бактериални и гъбични съобщества по време на развитието на A. Мали чревни микробиоти, както се определя с помощта на клъстерен анализ. 40-те рода с най-голямо относително изобилие бяха избрани и групирани в три групи въз основа на подобни профили (показани като топлинни карти). Всеки ред в топлинната карта е стандартизиран да има средна стойност нула и стандартно отклонение една. Интензивността на цвета в топлинната карта е пропорционална на стандартизираното относително изобилие на таксоните.

Ефектът на различните диети върху сглобяването на A. mali чревна микробиота

Кръгови диаграми на изобилието на бактериални и гъбични OTU в чревните микробни съобщества на A. Мали хранени с различни диети от листата на Halliana и Pumila. В легендите се показва таксономичната информация за OTU с шестте най-високи относителни количества.

Мрежа за съвместна корелация между бактериални и гъбични таксони

Създадена е корелационна мрежа, за да се разгадаят моделите на микробно съпътстване сред бактериални и гъбични таксони в чревната микробиота на A. Мали (Фиг. 4). Като цяло мрежата се състои от 36 възела и 35 ръба (с 21 положителни ръба и 14 отрицателни ръба). Тези възли са разпределени в четири бактериални тила, включително протеобактерии, актинобактерии, Firmicutes и Bacteroidetes и три гъбични тила, включително Basidiomycota, Ascomycota и Chytridiomycota. Наблюдавахме сложни взаимодействия между бактериални и гъбични таксони. Например, Кониотирий е в отрицателна корелация с Ервиния, Псевдомонада и Аноксибацилус; Гиберела е положително корелиран с Methyloversatilis и Pseudomonas и Аноксибацилус; Томентела беше свързан с положителни ръбове с Фузариум, Emericella, Stachybotrys, Нигроспора и Пиренохета; и Leucoagaricus беше свързан с положителни ръбове с Серратия, Паракок и Enhydrobacter.

Основни таксони на микробиота от A. mali

Устойчивите микробни таксони в чревната микробиота на A. Мали са идентифицирани въз основа на OTUs, присъстващи във всичките пет проби (фиг. 5). Общо 87 и 43 OTU бяха идентифицирани и определени като основни таксони, съответно в бактериалната и гъбичната общности, което отчита ниски пропорции от общите OTU (съответно = 3,37% и 8,16% за бактерии и гъби). За разлика от тях тези основни таксони представляват значителна част от показанията (съответно = 44,43% и 59,56% за бактерии и гъби; допълнителна фигура S4). Бактериалните ядра таксони са били предимно определени за Клебсиела, Stenotrophomonas, Серратия, Enhydrobacter, Achromobacter, Коринебактериум, Микрокок и Acinetobacter; и ядрените гъбични таксони принадлежат предимно на Aspergillus, Валемия, Фома, Кандида, Пеницилиум, Криптококи, Кладоспориум и Фузариум (Допълнителни таблици S1 и S2).

Диаграма на Вен на бактериалните и гъбични OTU в различни чревни микробиоти на A. Мали.

Дискусия

Насекомите приютяват различни чревни микроорганизми, които участват в много различни дейности, включително разграждането на лигноцелулозата; производството на хранителни вещества, витамини и компоненти на кохезионните феромони; азотно фиксиране и оползотворяване на азотни отпадъчни продукти; защита срещу паразити; насърчаване на промените в оцветяването на тялото; и синтез на стероли 15,28,29,30,31. Въпреки че натрупващите проучвания описват микробното разнообразие в червата на насекомите, особено при насекомите Coleoptera 15,28,30,32,33,34,35,36,37, към днешна дата няма доклад, който да описва промени в A. Мали чревни микробни общности по време на последователни етапи от живота и в отговор на различни диети. В настоящото проучване ние предлагаме ново описание на чревната микробиота, свързана с тази ябълка бупрестид чрез Illumina MiSeq високопроизводително секвениране на бактериалния 16S rDNA ген и гъбичните ITS генни региони.

Богатство и разнообразие на микробиота A. mali Червата

В сравнение с новооткритите възрастни, A. Мали възрастни, хранени с различни диети, показват повишено разнообразие в чревната микробиота. Ние предположихме, че храненето може да стимулира растежа на микробиота и да осигури нови таксони от диетата, за да възстанови богатството на общността в червата на насекомите 41. Нашите резултати обаче показаха, че има значително по-уникални OTU, които споделят OTU между всеки два етапа на живота, което изглежда странно предвид историята на живота на това насекомо и може да показва замърсяване на нашите проби. По този начин в бъдещите ни изследвания ще бъдат проведени по-строги процедури за контрол на замърсяването.

Изчерпателният анализ на общността през етапите на развитие на A. Мали и при насекоми, хранени с различни хранителни режими, се установява, че преобладават четири бактериални тила, включително протеобактерии, актинобактерии, Firmicutes и Bacteroidetes и две гъбични видове, включително Ascomycota и Basidiomycota. Този резултат се подкрепя от предишно проучване, подобно на това от предишно проучване, показващо, че протеобактериите и фирмикутите са преобладаващата бактериална фила в 81 проби от червата на насекомите 6. По същество от корояди са изолирани видове, принадлежащи към всички основни бактериални таксони, включително Alphaproteobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Actinobacteria 42. Доминиращата гъбична фила, наблюдавана през A. Мали е в съответствие с предишни наблюдения на голямо разнообразие от изолати на Basidiomycota и Ascomycota от Cerambycidae, Passalidae, Elateridae и рода на насекомите Hemiptera Дактилопий 20,38. Събирането на тези съобщества в микробиотата на храносмилателния тракт на насекомите може да се определи от физиологичните и биохимичните условия в тази среда, като морфология на червата, рН и наличност на кислород 5,43 .

Вариация на чревната микробиота по време на различни етапи на развитие

Според анализа на PCoA, чревната микробиота варира последователно в рамките на A. Мали етапи на развитие, като какавидите са ясно отделени от ларвите и новооткритите възрастни. В сравнение с ларвите и възрастните, червата на кученцата претърпява намалена метаболитна активност и претърпява морфологични промени по време на метаморфозата на насекомите, които могат да повлияят на свързаните с тях микробни съобщества 36 .

Вариация на чревната микробиота с различни диети

Чревните микробни общности могат да бъдат повлияни от диетата на гостоприемника, тъй като те се адаптират към диетичните промени чрез индуциране на производството на ензими и промени в структурата на общността 30. Бактериалните съобщества са сходни между новооткритите възрастни и възрастните, хранени М. пумила листа, докато големи разлики в структурите на гъбични общности са наблюдавани между новооткритите възрастни и възрастните, хранени с някоя от диетите. Този резултат показва, че бактериални таксони, обитаващи червата на A. Мали са по-адаптирани към М. пумила листа и че гъбичната общност е по-лесно засегната от различни диети.

За гъбичните съобщества преобладаващите OTUs в групата EcA не са в изобилие в групите MpuA и MhaA, а съставите на общността между групите MpuA и MhaA са подобни, се различават значително в изобилие. Хранителното поведение на A. Мали възрастните могат да обяснят сходния гъбичен състав между групите MpuA и MhaA 10. И двете групи са били хранени с листа от различни растителни видове, събрани от едно и също място, и много насекоми извличат чревната си микробиота от околната среда, включително от филоплана на хранителните растения 43 .

Сложни взаимодействия между чревната микробиота в A. mali

Основни таксони, свързани с потенциалните функции на чревната микробиота в A. mali

Заключение

Материали и методи

Събиране на проби

Повредени клонове на Malus siversii са събрани от дивата плодова гора, разположена в град Yining, автономна префектура Или, провинция Синцзян, Китай, на 26 юни 2015 г. Ларвите, какавидите и някои новооткрити възрастни от A. Мали се събират от повредените клони и се съхраняват в епруветки за центрофуги, след което червата веднага се дисектират. Останалите новооткрити възрастни, излюпени от ларви, събрани от повредените клони на Malus siversii, са отгледани с пресни листа от различни видове ябълкови дървета, включително Malus halliana Кьоне и Malus pumila Милър, в камера с изкуствен климат при 25 ± 1 ° C с 70 ± 5% относителна влажност и фотопериод от 16/8 (L/D). Експерименталният период на хранене е бил 20 дни (от 4 юли до 24 юли 2015 г.), за да се осигури образуването на чревна микрофлора. Двадесет индивида от всяка проба бяха избрани ръчно и дисекцията на червата беше извършена в рамките на 4 часа.

Дисекция на червата и екстракция на ДНК

PCR амплификация и обработка на последователни данни

Премахнати бяха сурови четения, които имаха замърсяващи адаптери, бяха с ниско качество и имаха полимерни последователности, по-дълги от 10 bp, имаха двусмислени основи или имаха несъответстващи грундове. За четене на сдвоени краища V3-V4 и ITS2 се сглобяват само чисти последователности с припокривания, по-дълги от 10 bp и със степен на несъответствие по-ниска от 0,02, в съответствие с техните припокриващи се последователности. Сглобените четения (наречени тагове) бяха използвани за премахване на излишни последователности с Mothur v.1.34.0 61. Поредици с ≥97% сходство бяха присвоени на една и съща OTU (оперативна таксономична единица). OTU с ниско изобилие бяха елиминирани от таблицата OTU, ако те не са имали поне 2 броя във всички проби в експеримента. Представителни последователности за всяка OTU бяха разпределени на таксономични групи, използвайки наивния байесов rRNA класификатор на проекта Ribosomal Database с базата данни Greengenes.

Анализ на данни

Индексите на алфа разнообразието, включително богатството на OTU, индекса на Shannon-Wiener, коригираната с отклонение оценка на богатството на Chao1 и оценката на покритието въз основа на изобилието (ACE) бяха определени с помощта на Mothur v1.34.0 и бяха използвани за анализ на микробното разнообразие на видовете в всяка проба 62. За да се идентифицират връзките между пробите, бета разнообразието между различните проби беше оценено въз основа на двойните разстояния на различия между Bray-Curtis. PCoA беше извършен върху матриците за разстояние, за да се визуализират пробните връзки. Динамични модели на бактериални и гъбични съобщества по време на развитието на A. Мали чревната микробиота се определя с помощта на клъстерен анализ. 40-те рода с най-голямо относително изобилие бяха избрани и групирани в три групи, базирани на подобни профили, които бяха показани в топлинна карта. Изградена е кръгова диаграма, за да се анализират вариациите на общността в A. Мали чревни микробиоти в резултат на различни диети. Създадени са диаграми на Venn, за да се оценят споделените и уникални бактериални и гъбични OTU, за да се опишат приликите и разликите между различните проби и лечения.

Използван е мрежов анализ за изследване на взаимодействията между бактериални и гъбични таксони. За този анализ са избрани бактериални и гъбични родове с относително изобилие над 0,05%. Корелацията на Спиърман между два рода се счита за значително стабилна, ако коефициентът (ρ) е> 0,6 или 63, igraph 64 и gplots 65 пакета, освен ако не е посочено друго.

Наличност на данни

Последователностите, произведени в това проучване, са достъпни в NCBI Sequence Read Archive (Bioproject PRJNA358858). Номерата за присъединяване на бактериите и гъбите в различните биопроби са SAMN06186591-SAMN06186600.