Резюме

  • ELISA, ензимно-свързан имуносорбентен анализ
  • GHRP, пептид, освобождаващ хормона на растежа
  • GHSR, рецептор на секретагога на растежния хормон
  • GTT, тест за глюкозен толеранс
  • HKRB, добавен от HEPES бикарбонатен буфер Krebs-Ringer
  • ITT, тест за толерантност към инсулин

Грелин, ацилиран 28-аминокиселинен пептид, беше изолиран от стомаха като ендогенен лиганд (1) за рецептора на секретагога на растежния хормон (GHSR) (2). Циркулиращият грелин се произвежда предимно в стомаха (3). Грелинът силно стимулира освобождаването и храненето на растежен хормон и проявява положителни сърдечно-съдови ефекти, което предполага възможно клинично приложение на грелин (4). Грелинът инхибира освобождаването на инсулин при мишки, плъхове и хора (5-8). Ниските плазмени нива на грелин са свързани с повишени нива на инсулин на гладно и инсулинова резистентност (9,10). Тези открития предполагат както физиологична, така и патофизиологична роля на грелина при освобождаването на инсулин.

извлечения

Въпреки че хранителната, ендокринната и невронната регулация на освобождаването на инсулин са добре характеризирани, много по-малко се знае за неговата авторегулация в островчетата. Грелин и GHSR също се намират в панкреатичните островчета (8,11–15). По-рано съобщихме, че в изолирани островчета, GHSR блокада и антисерум срещу ацилиран грелин значително засилва индуцираното от глюкоза повишаване на освобождаването на инсулин и концентрацията на цитозолен Ca 2+ в островчетата (8). Въпреки че екзогенният грелин потиска освобождаването на инсулин, този ефект изисква концентрация от 10 nmol/l, което е по-високо от нивата на циркулиращия грелин (16,17). Тези открития предполагат, че грелинът при относително високи концентрации, постигнати в островчетата, а не циркулиращият грелин, може да регулира секрецията на инсулин. Настоящото проучване изследва дали грелинът, произхождащ от панкреатичните островчета, може да регулира отделянето на инсулин и дали манипулацията с грелин може да повлияе на непоносимостта към глюкоза, свързана със затлъстяването. Тук показваме, че грелинът се освобождава от панкреатичните острови, за да регулира освобождаването на глюкоза, индуцирано от инсулин, и че нокаутиращите мишки на грелин избягват непоносимост към глюкоза, предизвикана от диета с високо съдържание на мазнини, поради засиленото отделяне на инсулин.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Мъжки плъхове Wistar (Япония SLC, Hamamatsu, Япония), нокаутиращи мишки грелин и мишки от див тип C57BL/6J (Charles River Laboratories Japan, Йокохама, Япония) бяха настанени в съответствие с нашите институционални насоки и с указанията на Японското физиологично общество за грижи за животни. Нокаутиращите мишки Грелин бяха любезният подарък на д-р. Т. Сато и М. Коджима (Университет Куруме). При тези мишки цялата генна последователност на грелин е изтрита. Животните бяха кръстосани със щам C57B6/J в продължение на поне шест поколения. Правилното заличаване на грелин гена е потвърдено чрез анализ на Southern и Northern blot. Проведена е тотална гастректомия при 6-седмични мъжки плъхове Wistar чрез резекция на стомаха, последвана от анастомоза на срезания ръб на хранопровода и горната част на йеюнума на 4 cm дистално от връзката на Treitz. След 2 месеца след операцията, гастректомирани плъхове бяха използвани за експерименти.

Измервания на плазмените концентрации на инсулин и грелин.

Грелин (Пептиден институт, Осака, Япония) и [d -Lys 3]-растежен хормон, освобождаващ пептид-6 ([d -Lys 3] GHRP-6; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО) са прилагани интраперитонеално на мъжки Wistar плъхове (на възраст 8 седмици) или гастректомизирани плъхове (на възраст 3 месеца) след гладуване през нощта. Кръв се получава от опашки и се измерват плазмените концентрации на инсулин, като се използва ензимно свързан имуносорбентен тест (ELISA) (Институт по биологични науки Morinaga, Йокохама, Япония). За измерване на плазмените концентрации на грелин се вземат кръвни проби от панкреатичните артерии (целиакия) и вените (вена на далака) и порталните вени на анестезирани плъхове или мишки. За да се избегне притокът на грелин от червата и стомаха към далачната вена, долната мезентериална вена и далачната страна на далачната вена - включително късите стомашни и леви гастро-оментални вени - са лигирани. Плазмените концентрации на ацилиран грелин и дезацилгрелин бяха измерени с помощта на ELISA комплекти (Mitsubishi Kagaku Iatron, Токио, Япония).

Морфологичен анализ на панкреатичните островчета при нокаут мишки от див тип и грелин.

Панкреатите от мъжки мишки от див тип и грелин са били фиксирани в 4% параформалдехид и са генерирани два до три произволни участъка на панкреас на мишка. Три мишки бяха изследвани във всеки генотип. Срезите бяха инкубирани през нощта с миши моноклонални анти-инсулинови антитела (Sigma-Aldrich) при разреждания 1: 1000 при 4 ° С. След това пробите бяха инкубирани в маркиран с Alexa Fluor 488 кози антимиши IgG (Molecular Probes, Eugene, OR). Имунофлуоресценция за инсулин се наблюдава с фотоумножители на многофотонен лазерно-сканиращ микроскоп (FluoView FV300-TP; Olympus, Токио, Япония). Броят на островчетата на единица площ на панкреаса и размерът на островчетата бяха измерени.

Измервания на освобождаване на инсулин в островчета.

Островчета Лангерханс са изолирани чрез разграждане на колагеназа от нокаути от мъжки грелин и мишки от див тип (C57BL/6J), както беше съобщено по-рано (8,18), с леки модификации. Животните се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на пентобарбитон при 80 mg/kg и колагеназа от 1,05 mg/ml (Sigma-Aldrich) се инжектира в общия жлъчен канал. Колагеназата се разтваря в разтвор на бикарбонатен буфер Krebs-Ringer (HKRB) с добавен HEPES (5 mmol/l Ca 2+) (в mmol/l: 129 NaCl, 5.0 NaHCO3, 4.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 2.0 CaCl2, 1.2 MgSO4 и 10 HEPES, рН 7,4, с 0,1% BSA). Панкреатите се дисектират и се инкубират при 37 ° С в продължение на 16 минути. Островчета бяха събрани и използвани за експерименти с освобождаване на инсулин. Групи от 12-15 островчета бяха инкубирани за 1 h в HKRB при 37 ° C с 2.8 mmol/l глюкоза за стабилизиране, последвано от тестово инкубиране за 1 h в HKRB с 2.8, 8.3 или 16.7 mmol/l глюкоза. Концентрациите на инсулин се определят чрез комплект ELISA (Институт по биологични науки Morinaga).

RT-PCR анализ в реално време.

Общата РНК на островчетата се изолира, използвайки TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) и се третира с RQ1-DNase (Promega, Madison, WI), за да се отстранят остатъчните замърсявания с ДНК. Синтезът на cDNA от първа верига е завършен с помощта на ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan). Праймерите за PCR в реално време бяха изследвани първо с HotStarTaq ДНК полимераза (94 ° C за 15 s, 55 ° C за 20 s и 72 ° C за 20 s × 30 цикъла; Qiagen, Hilden, Германия) и агарозна гел електрофореза за правилен размер на продукта и отсъствие на образуване на грунд-димер. Използвайки QuantiTect SYBR Green PCR комплект, PCR в реално време (95 ° C за 15 s, 55 ° C за 20 s и 72 ° C за 20 s × 35 цикъла) бяха извършени в ABI-Prism 7700 детектор за последователност (Приложен Biosystems, Фостър Сити, Калифорния). Натрупването на продукта се измерва в реално време и средният праг на цикъла (Ct; цикълът, по време на който продуктът се открива за първи път) се определя за репликирани проби (n = 5 независими реакции на двойка праймери и cDNA проба), изпълнявани на същата плака. Различни cDNA проби бяха нормализирани с помощта на праймерни комплекти към домакинския ген β-актин. Праймерите бяха, както следва: β-актин, 5′-TTCCCCTCCATCGTGGGCCGC-3 ′ и 5′-GATGGCTACGTACATGGCTGG-3 ′; Инсулин 1, 5′TAGTGACCAGCTATAATCAGAG-3 ′ и 5′-ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC-3 ′; и инсулин 2, 5′-CCCTGCTGGCCCTGCTCTT-3 ′ и 5′-AGGTCTGAAGGTCACCTGCT-3 ′.

Инфузионна перфузия на панкреаса.

Панкреатите бяха перфузирани, като се използва модификация на метода на Гродски и Фанска (19). Панкреатите са изолирани с сегменти на дванадесетопръстника и далака. Артериална канюла беше въведена в чревната артерия, а венозната канюла беше поставена в порталната вена. Изходният перфузат се състои от HKRB (рН 7,4), съдържащ 2,8 mmol/l глюкоза, 0,5% BSA и 4% Dextran T70. Перфузатът, поддържан при 37 ° С, непрекъснато се окислява в атмосфера от 95% O2/5% CO2. След 20-минутен преинкубационен период, всеки панкреас се перфузира в продължение на 10 минути с изходния перфузат. След това панкреатите се перфузират в продължение на 30 минути с 8,3 mmol/l глюкоза или 8,3 mmol/l глюкоза с тествани реагенти. Скоростта на потока се поддържа на 2.5 ml/min по време на измерванията. Фракциите, събрани в охладени епруветки на интервали от 1 минута, се съхраняват при -20 ° C, докато се анализират за имунореактивен инсулин.

Тестове за толерантност към глюкоза и тестове за толерантност към инсулин.

При проучвания за тест за толерантност към глюкоза (GTT), 2 g/kg глюкоза се инжектира интраперитонеално в мишки, последвано от вземане на кръв от вената на опашката. При проучвания за инсулинов толеранс (ITT), инсулин (0,75 единици/kg) се инжектира интраперитонеално, последвано от вземане на кръвни проби от опашната вена. Концентрациите на глюкоза в кръвта се измерват с помощта на GlucoCard DIA метър (Arkray, Kyoto, Япония), докато концентрациите на инсулин се определят с помощта на ELISA комплект (Morinaga Institute of Biological Science).

Статистически анализ.

Данните са средните стойности ± SE. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на тест на Student или еднопосочен ANOVA. P d -Lys 3] GHRP-6 (1 μmol/l) (фиг. 2А и С) и чрез имунонеутрализация на ендогенен грелин с антигрелин антисерум (0,1%) (фиг. 2В и С). Обратно, прилагането на екзогенен грелин (10 nmol/l) потиска и двете фази на индуцирано от глюкоза освобождаване на инсулин (фиг. 2А и С). Дезацил-грелин, който не може да активира GHSR (1,20), не е променил значително индуцираното от глюкоза освобождаване на инсулин (фиг. 2С). Нито едно от тези лечения не повлиява базалните нива на освобождаване на инсулин при 2,8 mmol/l глюкоза.