Резюме

Доброволното прехранване бързо предизвиква резистентност към ефектите на системния инсулин и лептин върху метаболизма на чернодробната глюкоза. За да проверим дали централното приложение на рекомбинантен лептин може да възстанови действието на лептин и инсулин върху потоците на чернодробна глюкоза, ние вливахме лептин в третата мозъчна камера на съзнателни прехранени плъхове по време на проучвания на панкреатично-инсулинова скоба. Ефектът на лептина върху фосфорилирането на сигналния преобразувател и активатора на транскрипция-3 в дъговидните ядра на хипоталамуса е подобен при животни, хранени с редовна диета или диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 3 дни. Инфузията на лептин в третата мозъчна камера значително инхибира производството на глюкоза при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, главно чрез намаляване на гликогенолизата. Инхибирането на гликогенолизата беше достатъчно за нормализиране на производството на глюкоза и беше придружено от индуцирано от лептин намаляване на чернодробната експресия на глюкозо-6-фосфатаза и фосфоенолпируват карбоксикиназа. По този начин централното приложение на лептин спасява чернодробната инсулинова резистентност, индуцирана от краткосрочна хиперфагия.

диабет

Лептинът е хормон, получен от адипоцити, който може да модулира приема на храна и действието на чернодробния инсулин (1–4). Циркулиращият лептин се транспортира в мозъка чрез наситена транспортна система, разположена както в ендотелния, така и в хориоидния сплит (5,6). След преминаване на кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​действията на лептина се медиират главно чрез дългата форма на лептиновия рецептор (OB-Rb), която е единствената изоформа, способна да активира JAK-сигналния преобразувател и активатора на транскрипцията (STAT ) пътека (7–9). Генетичният дефицит на лептин (ob/ob мишки), както и мутациите в лептиновия рецептор (db/db мишки, Zucker мастни [fa/fa] плъхове) водят до затлъстяване и диабет (10). При хората редки случаи на синдроми на моногенно затлъстяване също са описани по-рано (11).

Затлъстелите лица имат тежка инсулинова резистентност с високи нива на циркулация както на инсулин, така и на лептин (12,13). В това отношение неуспехът на повишените нива на лептин да възстанови нормалната енергийна и метаболитна хомеостаза обикновено се разглежда като доказателство за лептинова резистентност. Многобройни доклади при гризачи подчертават тежкото увреждане на аноректичното действие на лептина при модели с високо съдържание на мазнини (14-17). Тази придобита форма на лептинова резистентност се приписва на дефекти на ниво транспортиране на лептин в централната нервна система (ЦНС) и/или на ниво на лептинова сигнализация в ЦНС. В това отношение Van Heek et al. (16) съобщават, че индуцираните от диета затлъстели мишки развиват периферна, но не централна резистентност към лептина, докато El Haschimi et al. (14) и Munzberg et al. (15) отбелязват, че два дефекта допринасят за тяхната лептинова резистентност, нарушен транспорт на лептин в мозъка и намалена способност на лептин да активира STAT3 в дъгообразното ядро ​​на хипоталамуса.

Важното е, че има все повече доказателства, че лептинът също играе важна роля в модулацията на метаболитните потоци и действието на инсулина (18). Например, че лептинът обръща инсулиновата резистентност и диабета при мишки с вродена липодистрофия, независимо от ефекта му върху приема на храна, е показано по-рано (4,18–20). При постните плъхове системната или централна инфузия на лептин води до бързо преразпределение на чернодробните глюкозни потоци със силна стимулация на глюконеогенезата, съчетана с подобно инхибиране на гликогенолизата (4,19). Важното е, че ефектът на лептина върху глюконеогенезата, но не и върху гликогенолизата, зависи от централното активиране на меланокортиновите рецептори (4).

Резистентността към инсулин и лептин възникна в рамките на 3 дни след доброволно прехранване в щам на гризачи (плъхове Sprague-Dawley), податливи на наддаване на тегло в зависимост от възрастта и диетата (21). По-специално, краткосрочното прехранване предизвика сериозен дефект в способността на системната инфузия на лептин (50 μg) да модулира чернодробните глюкозни потоци (21). Тъй като показахме, че 1,5 μg лептин i.c.v. изцяло възпроизведен ефектът от 50 μg лептин, вливан системно върху чернодробните глюкозни потоци при стандартни диетични плъхове (19), нашата цел е да изясним дали централното приложение на лептин спасява действието на инсулина върху метаболизма на чернодробните въглехидрати.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Изследвани са възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Плъховете са настанени в отделни клетки и са подложени на стандартен цикъл светлина-тъмнина (светлините светват в 0600). Четиринадесет дни преди проучването in vivo, плъховете са оборудвани с постоянни катетри, поставени в третата мозъчна камера чрез стереотаксична хирургия (19,22). След пълно възстановяване (~ 10 дни), катетрите бяха поставени в дясната вътрешна югуларна вена и лявата каротидна артерия (19,22). След това плъховете бяха разделени на случаен принцип в две групи и хранени или със стандартна диета, или с много вкусна диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 3 дни. Стандартната чау (каталожен номер 5001; Purina Mills) осигурява 59% калории от въглехидрати, 20% от протеини и 21% от мазнини. Диетичната чау с високо съдържание на мазнини (каталожен номер 9398; Purina Mills) съдържа 45% калории от въглехидрати, 22% от протеини и 33% от мазнини.

Интрацеребровентрикуларни изследвания.

Експерименталният протокол тук е предназначен да изследва дали централната стимулация на лептиновата система възстановява нормалната инсулинова чувствителност при прехранените животни. Плъховете бяха разделени на две експериментални групи след пълно възстановяване от операции и разпределяне на стандартна диета или диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 3 дни, както е описано по-горе. Плъховете получават интрацеребровентрикуларна инфузия на който и да е носител (изкуствена цереброспинална течност; апарат на Харвард) в продължение на 6 часа или рекомбинантен лептин на мишка (1,5 μg/6 часа) (> 95% чист от SDS-PAGE; подарък от д-р M. McCaleb, Amgen, Thousand Оукс, Калифорния). Като цяло бяха проучени четири лечебни групи: 1) стандартна диета; 2) стандартна диета – лептин; 3) диета с високо съдържание на мазнини; и 4) диета с високо съдържание на мазнини - лептин. Всички плъхове са получили протокола за еугликемична/хиперинсулинемична скоба, описан по-долу през последните 2 часа от вливането на лептин. В края на проучванията in vivo, плъховете се анестезират (пентобарбитал 55 mg/kg телесно тегло, iv), а пробите от тъкани се замразяват на място чрез алуминиеви клещи, предварително охладени в течен азот и се съхраняват при -80 ° C за последващо анализ.

Изследвания на евгликемични/хиперинсулинемични скоби.

Проведени са проучвания на панкреатично-инсулинова скоба, както е описано по-горе, за да се получи физиологична хиперинсулинемия (4,19,23).

Медиобазален хипоталамус

Western blot анализи.

Генната експресия.

Чернодробно замразеният черен дроб е получен от животни, които са получили евгликемична/хиперинсулинемична скоба. Експресията на гена на PEPCK и глюкозо-6-фосфатазата (G6Pase) се анализира с количествена PCR (4).

Аналитични процедури.

Плазмената глюкоза беше измерена по метода на глюкозната оксидаза (Glucose Analyzer II; Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Плазмените концентрации на инсулин и лептин са измерени чрез радиоимунологичен анализ. Плазмената концентрация на свободни мастни киселини се определя по ензимен метод с автоматизиран комплект съгласно спецификациите на производителя (Waco Pure Chemical Industries, Осака, Япония). Радиоактивността на плазмената [3Н] глюкоза се измерва в два екземпляра в супернатантите на BA (OH) 2 и ZnSO4 утайки (процедура Somogy) на плазмени проби след изпаряване до сухо, за да се елиминира тритирана вода. Скоростта на усвояване на глюкозата и ендогенното производство на глюкоза са изчислени, както е описано по-рано (19).

Чернодробни глюкозни потоци.

Концентрациите на уридин дифосфоглюкоза (UDP-глюкоза) и фосфоенолпируват (PEP) и специфични активности в черния дроб са получени чрез две последователни хроматографски сепарации, както беше съобщено по-рано (20). Специфичните активности на чернодробната [14 C] PEP, [3 H] уридин дифосфоглюкоза (UDP-глюкоза) и [14 C] UDP-глюкоза бяха измерени чрез високоефективна течна хроматография и бяха изчислени скоростите на PEP глюконеогенеза. Процентът на чернодробния глюкозо-6-фосфатен пул, директно получен от плазмена глюкоза, се изчислява като съотношението на специфичните за черния дроб [3 H] UDP-глюкоза и плазмата [3 H-3] глюкоза (директен път). Глюконеогенезата (индиректен път) се изчислява от специфичните дейности на чернодробна 14-С-маркирана UDP-глюкоза (предполага се, че отразява специфичната активност на чернодробната глюкоза-6-фосфат) и чернодробна PEP след инфузията на [U-14 C] лактат и [3 H-3] глюкоза (19).

Статистика.

Всички стойности са представени като средна стойност ± SE. Разликите се считат за статистически значими при процедурата за затягане P-1 · min-1), предназначена да генерира физиологично увеличение (приблизително трикратно; Таблица 1) в плазмената концентрация на инсулин (Фиг. 1В).

Централното приложение на лептин възстановява инсулиновата чувствителност при прехранени плъхове. Мъжки плъхове Sprague-Dawley получиха имплантиране на интрацеребровентрикуларни канюли на ден 0 (3 седмици преди проучването in vivo) и венозни и артериални катетри на ден 14. След възстановяване от операцията (на ден 18), плъховете получиха експериментална диета ad libitum за 3 дни. A: Процедура за затягане е извършена на ден 21. B: Процедура за затягане на панкреас-инсулин. Плъховете получават интрацеребровентрикуларна инфузия на лептин или носител (aCSF, изкуствена цереброспинална течност) преди и по време на експериментите in vivo. След 120 минути се започва инфузия на [3Н] глюкоза. Процедурата за захващане започна на 240 минути. Това включва инфузията на соматостатин (3 μg · kg -1 min min -1), инсулин (3 mU · kg -1 минута -1) и глюкоза (според необходимостта за предотвратяване на хипогликемия). C: Интрацеребровентрикуларният лептин (▪, обща доза от 1,5 μg) увеличава скоростта на инфузия на глюкоза при прехранени плъхове (OF) до нивата, наблюдавани при плъхове, хранени със стандартна чау (SC). D: Инфузията на лептин (▪) или носител (□) не променя усвояването на глюкоза при стандартно хранени и прехранени животни. E и F: Интрацеребровентрикуларният лептин значително инхибира производството на глюкоза по време на скобата при прехранени, но не и при плъхове със стандартна диета. * P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Обща характеристика на експерименталните групи

По време на проучванията на панкреатично-инсулинови скоби, плазмените концентрации на глюкоза и инсулин са сходни във всички групи (Таблица 1). При плъхове със стандартна диета лептинът не повлиява скоростта на вливане на глюкоза (∼15 mg · kg −1 · min -1), необходима за предотвратяване на промени в плазмените нива на глюкоза (фиг. 1С). Както се очаква, прекомерно хранените плъхове развиват инсулинова резистентност, така че значително по-малко глюкоза (9,5 ± 1,3 mg · kg −1 · min −1; P −1 · min −1) (фиг. 1C).

Централното приложение на лептин нормализира чернодробното инсулиново действие при прехранени плъхове.

Ефект на интрацеребровентрикуларния лептин върху глюконеогенезата, гликогенолизата и чернодробната PEPCK иРНК при прехранени плъхове. Централното приложение на лептин значително намалява гликогенолизата (А) както при плъхове със стандартен чау (SC), така и при прехранени (OF). Обратно, централният лептин стимулира глюконеогенезата (В) при стандартна диета, но не и при прехранени плъхове. В: Освен това, интрацеребровентрикуларният лептин значително повишава чернодробната експресия на PEPCK при плъхове със стандартна диета. Краткосрочната хиперфагия (OF) сама по себе си повишава чернодробната експресия на PEPCK (C), но централното приложение на лептин значително инхибира PEPCK иРНК (C). * P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Принос на директния и индиректния път към чернодробния пул на UDP-глюкоза

След това оценихме чернодробното изобилие от PEPCK иРНК след централна инфузия на носител или лептин. При плъхове със стандартна диета централният лептин повишава експресията на PEPCK (4) (Фиг. 3С). За разлика от това, лечението с централен лептин води до значително потискане на експресията на PEPCK (фиг. 3С) при прехранени плъхове. По този начин централният лептин при прехранени плъхове намалява производството на глюкоза главно чрез инхибиране на гликогенолизата и чрез намалена експресия на PEPCK и G6Pase, съчетано с липса на стимулация на глюконеогенезата.

Интрацеребровентрикуларният лептин обикновено активира хипоталамусния STAT3 при прехранени плъхове.

Тъй като ранният етап от предаването на лептинов сигнал включва фосфорилиране и активиране на STAT3, ние също изследвахме ефекта на интрацеребровентрикуларния лептин върху фосфорилирането на хипоталамусния STAT3 при стандартна диета и прехранени животни (фиг. 4). Тридесет минути след интрацеребровентрикуларното инжектиране на лептин (2,5 μg) или носител, плъховете бяха убити и медиобазалните клинове на хипоталамуса бяха дисектирани и анализирани чрез Western blot. Общите нива на STAT3 протеин и β-актин (не са показани) са сходни сред всички групи. Интрацеребровентрикуларният лептин индуцира значително увеличение на STAT3 фосфорилирането на тирозин в позиция 705 (Tyr705) (25) в подобна степен при стандартна диета и прехранени плъхове. Базовите нива на Stat3-705 не са били повишени при прехранени плъхове. Освен това, транскрипционната активност на Stat3 може да бъде допълнително подобрена чрез лептин-независимо сериново фосфорилиране в позиция 727. Интересното е, че сериновото фосфорилиране на Stat3 (Ser727) не е повлияно нито от лептин, нито от краткотрайно прехранване на това място.

Зависима от лептин активиране на Stat3 при стандартна диета и прехранени плъхове. Имуноблоти от медиобазални хипоталами, получени от стандартна диета и прехранени плъхове, инжектирани с лептин (2,5 μg i.c.v.) или aCSF (изкуствена цереброспинална течност) и изследвани със Stat3-705 (фосфорилиране на тирозин) и Stat3-727 (фосфорилиране на серин). Интрацеребровентрикуларният лептин доведе до приблизително трикратна индукция на фосфорилирането на Stat3-705 при стандартно хранени и прехранени животни, докато Stat3-727 не се повлиява нито от лечението, нито от диетата.

ДИСКУСИЯ

Проучванията при хора и животни показват, че нарушеният транспорт на лептин през BBB допринася за лептиновата резистентност при затлъстяване. Няколко доклада от генетични модели на затлъстяване (26,34), мишки с индуцирано от диетата затлъстяване (15,16), но също така и проучвания при хора (35) съобщават за дефект в транспорта на лептин в ЦНС, който отчасти може да обясни тяхното намалено чувствителност към лептин. В допълнение към дефектен транспорт на лептин през BBB, промени в експресията на лептинов рецептор и в клетъчната сигнализация (14,15) също са наблюдавани в рамките на хипоталамуса и по-специално в дъгообразното ядро. Лептинът упражнява няколко от своите централни действия върху енергийната хомеостаза, като задейства пътя на меланокортина (22,36). В тази връзка Clegg и колеги (36,37) наскоро показаха, че консумацията на диета с високо съдържание на мазнини намалява активирането на пътя на меланокортина от синтетичен агонист. По този начин, по отношение на ефектите на лептина върху енергийния метаболизъм, дългосрочното (> 2 седмици) излагане на диета с високо съдържание на мазнини изглежда предизвиква множество дефекти на нивата на транспорта на ВВВ, рецепторната експресия, активирането на STAT3 и ефекторните пътища надолу по веригата като пътя на меланокортина.

Острите ефекти на лептина върху глюкозната хомеостаза са доста сложни. Що се отнася до бързото регулиране на чернодробните глюкозни потоци, наскоро идентифицирахме меланокортин-зависими и меланокортин-независими ефекти на системния или централния лептин (4). Лептинът силно инхибира чернодробната гликогенолиза при съзнателни плъхове чрез независим от меланокортин механизъм. Обаче, активирането на централния път на меланокортин от лептин също води до стимулиране на глюконеогенезата и на чернодробната експресия на PEPCK и G6Pase. Интересното е, че лептинът значително потиска производството на глюкоза при слаби плъхове, когато активирането на централния път на меланокортина беше селективно блокирано (4).

В заключение предполагаме, че две различни промени в метаболитните действия на лептина се предизвикват бързо чрез прехранване при плъхове Sprague-Dawley. Първият е дефект в трансфера на циркулиращия лептин към местата му на действие в хипоталамуса, а вторият е селективно увреждане на централния лептин, сигнализиращ към чернодробната глюконеогенеза, вероятно чрез пътя на меланокортина (Фиг. 5). Може би най-важното, селективните промени в сигнализирането на централния лептин, предизвикани от прехранване в този модел, изглежда освобождават мощен ефект на централния лептин върху производството на чернодробна глюкоза. Последният ефект е достатъчен, за да се обърне напълно тежката чернодробна инсулинова резистентност, предизвикана от хранене с високо съдържание на мазнини. Взети заедно, тези резултати прокарват представата, че повишаването на централната наличност на лептин може да бъде нова стратегия за лечение на индуцирана от диетата чернодробна инсулинова резистентност.

Благодарности

Тази работа получи подкрепа от AECOM Diabetes Research & Training Center Grant DK-20541. L.R. е получил Национални здравни институти безвъзмездна помощ DK-48321, DK-45024 и AG21654. ТАКА. е получател на награда за младши факултети от Американската диабетна асоциация. А. П. е получател на докторантска стипендия от Американската диабетна асоциация.

Благодарим на Bing Liu, Clive Baveghems и Stanislaw Gaweda за експертна техническа помощ.