Субекти

Резюме

Въведение

Болестта на Паркинсон е невродегенеративно състояние, причинено от нараняване в допамин-продуциращите области на мозъка, особено в невроните на substantia nigra pars compacta (SNc) и техните аксонални проекции към стриатума. Болестта на Паркинсон се характеризира с прогресивни нарушения на движението, включително брадикинезия, тремор в покой, скованост и постурална нестабилност 1. Епидемиологичните данни разкриват двукратно нарастване на разпространението на това заболяване през последните 25 години, надминато само от болестта на Алцхаймер сред всички невродегенеративни заболявания 2. Въпреки няколко проучвания, предполагащи ролята на факторите на околната среда и генетичните фактори, етиологията на болестта на Паркинсон все още е слабо разбрана 3. Основните патогенетични компоненти на заболяването са митохондриални увреждания, нарушена протеазомна деградация на протеини, неправилно нагъване, оксидативен стрес и невро възпаление 1,4,5,6. Леводопа, МАО-В и COMT инхибитори, допаминови агонисти, β-блокери и производни на адамантан с антагонизъм на NMDA рецепторите са най-често използваните възможности за лечение 7,8. Механизмът на действие на тези лекарства включва улесняване на допаминергичното предаване в компрометирани неврони или корекция на дисбаланса в невромедиаторните системи.

Анксиолитичното лекарство афобазол (етокси-2- [2- (морфолино) -етилтио] бензимидазол дихидрохлорид) е разработено и фармакологично изследвано във ФСБИ „Изследователски държавен институт по фармакология на Закусов“ 37. Лекарството има афинитет към Sigma1Rs (Ki = 5.9E-6 M) и регулаторни сайтове на NQO2 (Ki = 9.7E-7 M) и MAO A (Ki = 3.6E-06 M) 38 . Инвитро и in vivo експерименти с афобазол разкриват цитопротективни и невропротективни свойства на лекарството 39,40,41,42. Нашите скорошни резултати показаха способността на афобазола да предотвратява намаляването на стриаталния допамин в модела на 6-OHDA-индуциран паркинсонизъм 43; обаче, ролята на гореспоменатите молекулни мишени на афобазол не е определена. Целта на настоящото проучване беше да се определи ролята на Sigma1Rs в медиирания от афобазол нормализиращ ефект върху съдържанието на допамин в стриатума в in vivo миши модел на болестта на Паркинсон, индуциран от 6-OHDA лезии.

Резултати

медиира

Подобно на съдържанието на DOPAC, съдържанието на HVA също е намалено в увредения стриатум на третирани с носител мишки и афобазолът няма значителен ефект върху тази стойност (фиг. 3). Съдържанието на HVA в 6-OHDA-легирания стриатум на третирани с PRE-084 мишки беше по-ниско от това в непокътнатия стриатум, но беше значително по-високо от това в увредения стриатум на третирани с превозни средства мишки. Предварителното приложение на антагониста на Sigma1R BD-1047 засяга мишки, третирани с афобазол и PRE-084, предотвратявайки увеличаване на HVA (фиг. 3). Не са открити значителни разлики в съдържанието на DA, DOPAC и HVA в непокътнат стриатум между експериментални групи (Фигури 1-3). Метаболитните съотношения DOPAC/DA, HVA/DA и (DOPAC + HVA)/DA бяха значително повишени в 6-OHDA увредения стриатум на мишки, третирани с носител. Лечението с афобазол понижава съотношенията HVA/DA и (DOPAC + HVA)/DA, докато PRE-084 няма откриваем ефект (Таблица 1).

Продължителното лечение с афобазол в доза от 2,5 mg/kg запазено съдържание на DA в 6-OHDA лезиран стриатум, беше придружено от значително увеличение на относителния брой TH + неврони в SNc (фиг. 4) и латентност за падане в rotarod тест (S. Фиг. 1). Открита е силна положителна корелация между нивото на DA и броя на SNc TH + неврони (R = 0,85, p Фигура 4

Корелационен анализ на броя на TH + невроните в съдържанието на ipsilateral SNc и DA в стриатума. Лек кръг - животни, третирани с бутафорни превозни средства (n = 6); тъмен кръг - 6-OHDA лезирани животни, третирани с превозни средства (n = 7); лек квадрат - животни, третирани с афобазол с 6-OHDA, в доза от 2,5 mg/kg (n = 9); син цвят - клъстер 2, червен цвят - клъстер 1; R = 0,85 p = 0,000001; линия на най-подходящото уравнение DA = 14.395 + 5.6337 * x.

При ротарод теста средната латентност за падане на лекувани с носител мишки с 6-OHDA лезии намалява пет пъти в сравнение с тази на фалшиво оперирани животни (фиг. 6). Afobazole и PRE-084 значително увеличиха латентността на спада при хемипаркинсоничните животни. Предварителното приложение на BD-1047 антагонизира действието на афобазола. По същия начин, предварителната обработка с BD-1047 намалява латентността на падането на мишки, третирани с PRE-084, в сравнение с тази на мишки с фалшива операция или мишки, третирани с PRE-084 (фиг. 6). Не се наблюдава значителна разлика в латентността на падане при ротарод теста при наивни непокътнати и третирани с превозни средства животни в сравнение с фалшиви мишки (S. Фиг. 2). Лигандите на Sigma1R и неговите комбинации не оказват влияние върху представянето на наивни мишки в ротарод теста (S. Фиг. 2). Нашите данни показват силна положителна връзка между съдържанието на DA в стриатума и латентността на падане (R = 0,77, p Фигура 6

Корелационен и клъстер анализ на връзката между стриаталното съдържание на DA и латентността за падане при ротарод теста. Лек кръг - животни, третирани с бутафорни превозни средства; тъмен кръг - животни, третирани с превозни средства с 6-OHDA; лек квадрат - животни, третирани с афобазол с 6-OHDA, в доза от 2,5 mg/kg; тъмен квадрат - животни, лекувани с 6-OHDA, лекувани с афобазол в доза 2,5 mg/kg с предварителна обработка BD-1047 в доза 3,0 mg/kg; лек триъгълник - третирани с 6-OHDA животни, третирани с PRE-084 в доза от 1 mg/kg; тъмен триъгълник - лекувани с 6-OHDA PRE-084-третирани животни в доза 1,0 mg/kg с предварителна обработка BD-1047 в доза 3,0 mg/kg; син цвят - клъстер 2, червен цвят - клъстер 1. K-означава групиране на данни демонстрира, че първият клъстер се състои от мишки, третирани с фалшиви и третирани с афобазол или PRE-084 (с изключение на случай # 28). Вторият клъстер се състои от третирани с носител или BD-1047 предварително обработени мишки (с изключение на случаи # 12, # 42, # 48, # 55 и # 56). R = 0,77 p = 0,000000; линия на най-подходящото уравнение DA = 21,2193 + 0,4532 * x. Експерименталните групи се състоят от 10 мишки, с изключение само на третирани с афобазол, които са били 9.

Групирането на данни K-средства демонстрира разделянето на експериментални мишки на две големи групи. Първият клъстер беше представен от фалшиво оперирани и третирани с афобазол или PRE-084 мишки (с изключение на случай # 28), докато вторият клъстер се състоеше от третирани с носител или BD-1047 мишки (с изключение на случаи # 12, # 42, # 48, # 55 и # 56). Животните, чиито експериментални характеристики се открояват от тези на групата и се оказват в противоположния клъстер, са на максимално разстояние от центъра на своя клъстер (Фиг. 7).

Дискусия

Настоящото проучване за първи път характеризира приноса на Sigma1Rs в невропротективните ефекти на афобазола в in vivo 6-OHDA модел на болестта на Паркинсон. Едностранното интрастриално инжектиране на 6-OHDA води до намаляване на съдържанието на DA в стриатума, което е кръстосано свързано със смъртта на TH + неврони в SNc и ниска латентност при падане при ротарод тест. Тези фенотипни характеристики представляват патогенетични механизми на болестта на Паркинсон и са в съответствие с докладваните по-рано резултати в този модел 44,45. Афобазол, прилаган в доза от 2,5 mg/kg, предотвратява развитието на нарушения, причинени от невротоксичност, поради което демонстрира своята невропротективна активност, доказана от високата кръстосана корелация между съдържанието на DA в стриатума и латентността при падане при ротарод тест или TH + броя. Невропротекцията в 6-OHDA модела на болестта на Паркинсон се характеризира с предотвратяване на смъртта на TH + неврони и нормализиране на съдържанието на DA в стриатума и активността на движение 13,46,47. Значителното намаляване на метаболитните съотношения на DA, причинено от афобазол, също е в съответствие с експериментални данни, които характеризират невропротекцията при модели на болестта на Паркинсон 11,48 .

Ефектите на афобазола и агониста на Sigma1R PRE-084, прилагани при 1,0 mg/kg, показват много прилики, както е потвърдено от клъстерния анализ. Един от двата клъстера експериментални животни е представен от фалшиви мишки и мишки, които са получавали само афобазол или PRE-084. Наблюдаваният ефект на афобазол е в съответствие с описания по-рано невропротективен ефект на PRE-084 при мишки C57BL/6 в модела 6-OHDA на болестта на Паркинсон 11 .

Взети заедно, настоящото проучване демонстрира важната роля на Sigma1Rs в невропротективния ефект на афобазол в 6-OHDA модела на болестта на Паркинсон и предполага, че използването на агонисти на Sigma1R може да бъде от полза като лечение на болестта на Паркинсон.

Методи

Химикали

Използвани са следните химикали: афобазол (5-етокси-2‐ [2‐ (морфолино) -етилтио] бензимидазол дихидрохлорид) (FSBI „Изследователски държавен институт по фармакология на Закусов“), PRE-084 (Tocris), BD-1047 (Tocris ), 6-хидроксидопамин хидрохлорид (6-OHDA), аскорбинова киселина, NaCl, захароза, параформалдехид (PFA), поликлонални антитела срещу тирозин хидроксилаза T8700 (Sigma-Aldrich), вторични антитела, конюгирани с CF488 флуорохром SAB4600045 (Sigma-AoldrichS), 4 ′, 6-диамидино-2-фенилиндол, Triton X-100, хлоралхидрат, 3,4-дихидроксибензиламин хидробромид (DHBA), допамин (DA), 3,4-дихидроксифенилоцетна киселина (DOPAC), хомованилова киселина (HVA), KH2PO4, H3PO4, HClO4, лимонена киселина, EDTA-Na2, октансулфонова киселина, ацетонитрил и Tissue Tek OCT средно.

Експериментални животни

Изследването е проведено при мъжки ICR (CD-1) мишки (25–30 g, n = 152), получени от Център за размножаване в Пущино (клон на Института по биоорганична химия, Руска академия на науките). Животните бяха настанени при стандартни условия на вивариум (20–22 ° C, 30–70% влажност, 12-часов цикъл светлина/тъмнина) в пластмасови клетки с постелки от дървени стърготини и 10 животни на клетка.

Етично одобрение

Всички експериментални процедури са одобрени от комитета по биоетика на ФБИ „Изследователски институт по фармакология Закусов“. Бяха спазени всички приложими национални 73 и международни 74 насоки за грижите и използването на опитни животни.

6-OHDA лезия

Тридесет минути преди операцията, животните се анестезират с хлоралхидрат (400 mg/kg интраперитонеално) 45,75. Анестезираните животни бяха поставени в стереотаксичната рамка (Stoelting Co., Обединено кралство) и 6-OHDA беше инжектирана в десния стриатум съгласно координатите A = 0,4, L = 1,8 и V = -3,5 спрямо bregma 45. 6-OHDA се разтваря при 5 μg на 1 μL разтвор, съдържащ 0.9% NaCl и 0.02% аскорбинова киселина. Експерименталните животни се инжектират с 1 μL от разтвора 6-OHDA със скорост 0,5 μL/min, като се използва спринцовка Hamilton, снабдена с игла от неръждаема стомана с калибър 30. Иглата е изтеглена 2 минути след инжектирането. На подправени животни се инжектира 1 μL физиологичен разтвор с 0,02% аскорбинова киселина при същите координати.

Лечение с лекарства

Всички животни бяха третирани със същите дози изследвани съединения в продължение на 14 дни, с изключение на наивни непокътнати животни.

Тест на Rotarod

Моторното поведение беше изследвано при мъжки ICR мишки, използвайки апарат Rota-rod/RS LE 8500 (апарат Panlab/Harvard). Бяха проведени две тренировки с интервал от 24 часа, за да се аклиматизират експерименталните животни към апарата и да се изключат хиподинамичните животни от изследването. Първата тренировъчна сесия беше проведена на дванадесетия ден след операцията. Всяко животно се поставя на пръта два пъти, докато се върти със скорост 4 оборота в минута, с 1-часов интервал между сесиите. По време на втората сесия скоростта на въртене беше увеличена до 10 оборота в минута. Животните, неспособни да държат пръчката повече от 1 минута, бяха изключени от проучването 44. В настоящото проучване всички животни успяха да държат пръчката повече от една минута, така че нито едно от тях не беше изключено от експеримента.

На 14-ия ден след операцията мишките бяха поставени върху пръчка, въртяща се с 20 оборота в минута, и беше измерена латентността за падане. Всяко животно беше тествано три пъти, с интервали от 30 минути между опитите. Ако експерименталното животно е било в състояние да задържи пръчката за 120 s, измерването на времето се спира. Максималното време на трите опита е използвано за статистически анализ. В дните с тренировъчни сесии и ротарод тест, лекарства се прилагат след предварителна подготовка или тестване.

HPLC-ED техника

Имунохистохимичен анализ

Плътността на TH-положителните (TH +) неврони с ядра в равнината на среза се отчита при 40-кратно увеличение с помощта на софтуера ImageJ (Национален здравен институт). Преброяването се извършва в 3–6 среза на SNc (рострален, медиален и опашен регион) от всяко животно, получено при същите условия на микроскопия, т.е. време на експозиция 800 ms, печалба 1,1. При всяко животно клетките от ipsi- и контралатералните страни по отношение на инжектирането на 6-OHDA бяха преброени в 5-7 зрителни полета (0,044 mm 2) и беше изчислена средната стойност. Плътността на SNc невроните от ипсилатералната страна се изразява като процент от контралатералната страна.

Статистически анализ

За да се оцени вида на експерименталното разпределение на данните, бяха използвани тестовете на D’Agostino-Pearson и Shapiro-Wilk. Тъй като данните за съдържанието на DA и латентността за падане в ротарод теста не отговарят на Гаусово разпределение в повечето групи, бяха използвани тестът на Wilcoxon и Kruskal-Wallis с post hoc тест на Dunn. ANOVA с Holm-Sidak post hoc тест се използва за оценка на статистическата значимост на броя на TH + невроните. Анализът на линейно свързване на съдържанието на DA в стриатума с относителния брой TH + неврони или латентността на падане в ротародния тест беше извършен с помощта на корелационен анализ на Spearman. Табличните данни са представени като медиани с долни и горни квартили (Mdn (q25-75)). Данните в хистограмите се представят като медиана с минимума и максимума (Mdn (min-max)) и средната стойност. Животните бяха класифицирани като се използва к-средно групиране по съдържание на DA в стриатума и латентност за падане в rotarod теста като променливи. Населението беше разделено на два клъстера. Статистическият анализ на суровите данни и визуализацията на получените резултати бяха извършени с помощта на GraphPad Prism версия 8.0.1 за Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com и Statistica (StatSoft, Inc).

Наличност на данни

Наборите от данни, анализирани в това проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.