Катедра по фармакология, FB 14, Гьоте университет, Франкфурт, Германия

Катедра по фармакология, FB 14, Гьоте университет, Франкфурт, Германия

Катедра по фармакология, FB 14, Гьоте университет, Франкфурт, Германия

Катедра по фармакология, FB 14, Гьоте университет, Франкфурт, Германия

Катедра по фармакология, FB 14, Гьоте университет, Франкфурт, Германия

Катедра по фармакология, FB 14, Гьоте университет, Франкфурт, Германия

Резюме

Заден план

Известно е, че кетонните тела заместват глюкозата като мозъчно гориво, когато наличността на глюкоза е ниска. Кетогенните диети са описани като невропротективни. Подобни данни са докладвани за трихептаноин, мастно масло и анаплеротично съединение. В това проучване проследихме промените на енергийните метаболити в черния дроб, кръвта и мозъка след преходна мозъчна исхемия, за да тестваме за образуване на кетонни тела, предизвикано от експериментален инсулт.

Методи и резултати

Мишките бяха хранени със стандартна богата на въглехидрати диета или с 2 богати на мазнини диети, 1 обогатена с трихептаноин и 1 със соево масло. Инсулт се предизвиква при мишки чрез запушване на средната церебрална артерия в продължение на 90 минути, последвано от реперфузия. Мишките бяха жертвани и бяха получени кръвна плазма и хомогенати на черния дроб и мозъка. В 1 експеримент е извършена микродиализа. Метаболитите (напр. Глюкоза, β-хидроксибутират, цитрат, сукцинат) се определят чрез газова хроматография – масспектрометрия. След 90 минути мозъчна исхемия нивата на β-хидроксибутират се повишават драстично в черния дроб, кръвта и мозъчния микродиализат и мозъчния хомогенат, но само при мишки, хранени с богати на мазнини диети. Нивата на глюкоза се променят по обратния начин в кръвта и мозъка. Реперфузията намалява β-хидроксибутират и повишава глюкозата в рамките на 60 минути. Индуцирана от инсулт кетогенеза се блокира от пропранолол, антагонист на β-рецептора. Цитратът и сукцинатът са били умерено повишени при богати на мазнини диети и непроменени след инсулт.

Заключения

Ние заключаваме, че мозъчната исхемия предизвиква образуването на β-хидроксибутират (кетогенеза) в черния дроб и консумацията на β-хидроксибутират в мозъка. Изглежда, че този ефект се медиира от β-адренергичните рецептори.

Въведение

Инсултът е водеща причина за смърт и инвалидност, 1, 2 ситуация, отчасти причинена от недостиг на успешни лечения като фармакологични интервенции с рекомбинантен тъкан активатор на плазминоген или механична тромбектомия. 3, 4 Поради големия брой неуспешни клинични проучвания с невропротективни средства, 5, 6 диетични подхода за намаляване на тежестта на мозъчната исхемия придобиха популярност през последното десетилетие. Въпреки че глюкозата е основното гориво на мозъчния метаболизъм, 3 кетонни тела като ацетоацетат и β-хидроксибутират (BHB) могат да заменят до 50% глюкоза, за да доставят необходимата метаболитна енергия за мозъчната функция. Този принос е особено важен през ранния живот и по време на глад. 4 При мозъчна исхемия е известно, че хипергликемията е вредна, докато кетонните тела са свързани със значителни ползи. Всъщност богатите на мазнини и кетогенни диети са предложени като невропротектори 5, а данните при животни показват благоприятни ефекти на кетогенните диети в експериментални изследвания на инсулт. 6 Освен това е установено, че приложението на BHB предотвратява смъртта на невронални клетки в клетъчни култури и в животински модели на неврологично заболяване. 7, 8, 9

Алтернатива на кетогенната диета може да бъде трихептаноин, триглицерид, съдържащ хептаноат, нечетна C7-мастна киселина. Предполага се, че трихептаноинът действа като анаплеротично съединение, попълващо субстрати от цикъла на лимонената киселина, като сукцинат. 10 Трихептаноинът е полезен при дълговерижни митохондриални β-окислителни нарушения. 11 Неотдавнашната работа също показа, че трихептаноинът е полезен при епилепсия, където кетогенната диета отдавна има място в лечението. 12 По-рано съобщихме, че богата на трихептаноин диета намалява смъртта на невроналните клетки след преходна мозъчна исхемия при мишки. 13 Тъй като предварителните данни от нашата лаборатория показват, че трихептаноинът също индуцира кетогенеза, ние инициирахме настоящото проучване, в което сравнихме стандартна диета, богата на трихептаноин диета и диета със соево масло за ефекта им върху нивата на глюкозата и BHB в черния дроб, кръвта, и мозъка. Открихме драматична, предизвикана от инсулт кетогенеза при мишки на богати на мазнини диети, придружена от противоположни промени в нивата на глюкозата и предотвратена от блокада на адренергичните β-рецептори.

Методи

Експериментални групи

За експериментите са използвани женски мишки CD ‐ 1 (29–32 g; лаборатории на Charles River). Те са били държани в стандартни клетки, при 60% влажност, температура 22 ° C и 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Храната и водата се предлагаха ad libitum. Изследването е регистрирано в местния комитет по животните (Regierungspräsidium Darmstadt). В съответствие с насоките на GV-Solas, всички процедури са проектирани да минимизират страданието на експерименталните животни.

Мишките бяха рандомизирани да учат групи, използвайки компютърна програма за генериране на произволни числа. Общо за това проучване са използвани 173 мишки. Като цяло 24 експеримента не могат да бъдат проследени поради хирургични проблеми (недостатъчна блокада на средната церебрална артерия, непрекъснато кървене по време на реперфузия) и мишките трябва да бъдат жертвани. В 17 експеримента аналитичните проблеми причиняват неуспех за получаване на данни (липса на перфузия в сондата за микродиализа, проблеми по време на обработката на пробата и измервания на газова хроматография-мас спектрометрия). Резултатите, показани на фигури 1, 2, 3, 4, 5 до 6, са получени от 132 успешни експеримента (със средно 8 експеримента на група). Бяха проведени отделни експерименти за генериране на фигури, с изключение на това, че резултатите на фигури 3 и 5 са ​​от същата група животни. Аналитични измервания чрез газова хроматография-масспектрометрия бяха направени от 3 различни изследователи, с идентични резултати.

чернодробна

Фигура 1. Промени в нивата на метаболитите в микродиализатите преди (базален), по време (инсулт) и след (реперф.) Преходно (90 минути) запушване на средната мозъчна артерия: (A) глюкоза, (B) лактат, (C) β-хидроксибутират (BHB ). Мишките бяха държани на диети, богати на въглехидрати (стандартна диета; Altromin), на трихептаноин (Trihept.), Или на соево масло (соя) в продължение на 3 седмици. Данните са концентрации, които са изчислени от 6 проби, взети преди, по време или след инсулт и са средни ± SD от 6 експеримента. Статистиката е изчислена чрез еднопосочен ANOVA и Tukey post-test; **P # P ## P

Фигура 2. Концентрации на β-хидроксибутират (BHB) в (A) чернодробен хомогенат, (B) кръвна плазма и (C) мозъчен хомогенат (исхемично полукълбо). Взети са проби или от нелекувани животни (Ctl.), Или веднага след 90 минути преходна оклузия на средната церебрална артерия (инсулт) от мишки, отглеждани на стандартна диета (стандартна) или на диета, богата на соево масло (соево масло). Данните са дадени като средна стойност ± SD (n = 6). Статистиката е изчислена чрез еднопосочен ANOVA и Tukey post-test; *P

Фигура 3. Концентрации на глюкоза в (A) чернодробен хомогенат, (B) кръвна плазма и (C) мозъчен хомогенат (исхемично полукълбо). Взети са проби или от нелекувани животни (Ctl.), Или веднага след 90 минути преходна оклузия на средната церебрална артерия (инсулт) при мишки, отглеждани на стандартна диета (стандартна) или на диета, богата на соево масло (соево масло). Данните са дадени като средна стойност ± SD (n = 6). Статистиката е изчислена чрез еднопосочен ANOVA и Tukey post-test; **P ## P

Фигура 4. Промени в (A) β-хидроксибутират (BHB) и (B) глюкоза след 60 минути реперфузия, измерени в лявото (исхемично) мозъчно полукълбо. Взети са проби или веднага след края на 90 минути преходна оклузия на средната церебрална артерия (инсулт) или след 60 минути реперфузия (Reperf.) На мишки на стандартна диета (стандартна) или на диета, богата на соево масло (соева диета) ). Данните са дадени като средна стойност ± SD (n = 6). Статистиката е изчислена чрез еднопосочен ANOVA и Tukey post-test; **P ## P

Фигура 5. Концентрации на цитрат в (A) чернодробен хомогенат, (B) кръвна плазма и (C) мозъчен хомогенат (исхемично полукълбо). Взети са проби или от нелекувани животни (Ctl.), Или след 90 минути преходна оклузия на средната церебрална артерия (инсулт) при мишки на стандартна диета (стандартна) или на диета, богата на соево масло (соева диета). Данните са дадени като средна стойност ± SD (n = 6). Статистиката е изчислена чрез еднопосочен ANOVA и Tukey post-test; *P # P ## P

Фигура 6. Промени в (A) β-хидроксибутират (BHB) и (B) глюкоза в чернодробни хомогенати, взети от нелекувани мишки (Ctl.), След 90 минути преходна оклузия на средната церебрална артерия при нелекувани мишки (инсулт) или при мишки, получили пропранолол (проп; 2 mg/kg IP) преди индукция на инсулт. Мишките са били хранени със стандартна диета (стандартна) или диета, богата на соево масло (соева диета) в продължение на 3 седмици. Данните са дадени като средна стойност ± SD (n = 6). Статистиката е изчислена чрез еднопосочен ANOVA и Tukey post-test; *P ## P

Използвани са три диетични групи: стандартна богата на въглехидрати диета, богата на трихептаноин диета и богата на соево масло диета. Диетите бяха изокалорични и се хранеха в продължение на 3 седмици, с храна и вода на разположение ad libitum. Стандартната диета (Altromin 1326 за мишки; Altromin Co) съдържа 64% въглехидрати, 24% протеини и 12% мазнини (изчислено като процент на калории). Диетата с трихептаноин (Ssniff Co) съдържа 14% трихептаноин (тегло/тегло), което представлява 35% от общия калориен прием (въглехидрати 48%, протеини 17%). Диетата, богата на мазнини, се състоеше от същото калорично количество соево масло (35%) с 48% въглехидрати и 17% протеини и също беше приготвена от Ssniff Co. Количествата фибри (4%) и пепел (5,5%) бяха идентични в трите диети, както и хранителните добавки, които включват витамини A, C, D3, E, K3 и мед.

Проучването се състои от 2 части. В първата част (фигури 1 и 2) богатата на трихептаноин диета беше сравнена с диетата със соево масло, подобно на предишни проучвания. 12, 13 И двете диети са имали един и същ състав, с изключение на мастната съставка (виж по-горе). В този експеримент мишките бяха имплантирани с микродиализни сонди преди индукция на инсулт и нивата на метаболит бяха измерени в диализати. В допълнение, концентрациите на BHB и някои енергийни метаболити (цитрат, сукцинат, фумарат, малат) са измерени чрез газова хроматография-масспектрометрия в плазмата и в чернодробните и мозъчните хомогенати.

Във втората част на проучването (фигури 2, 3, 4, 5–6), мишките са били хранени или с богата на мазнини соева мазнина, или с богата на въглехидрати стандартна диета (Altromin 1326). В този експеримент глюкозата, BHB и енергийните метаболити са измерени чрез газова хроматография-масспектрометрия в хомогенати на черния дроб, кръвта и мозъка. В някои експерименти 2 mg/kg (±) -пропранололов хидрохлорид (99% чист, разтворен във физиологичен разтвор; Sigma-Aldrich) се дава чрез интраперитонеална инжекция 15 минути преди индукцията на инсулт.

Преходна оклузия на средната церебрална артерия

Газова хроматография - измервания на масова спектрометрия

Проби от кръвна плазма, черен дроб и мозък се събират веднага след обезглавяването на мишки, замразяват се в течен азот и се съхраняват при -80 ° C до измерването. Мозъчните и чернодробните хомогенати се екстрахират, използвайки двуфазна процедура на Folch, 17, водният супернатант се суши под поток от азот и сухите остатъци се дериватизират с BSTFA (N, O-bis [триметилсилил] трифлуороацетамид) и TMCS (триметилхлорозилан; 99: 1). В плазмените проби протеините се утаяват чрез добавяне на метанол: вода (9: 1) и се центрофугират и супернатантите се третират, както е описано по-рано. Пробите от микродиализат бяха просто изсушени и дериватизирани директно с BSTFA/TMCS (99: 1).

Пробите бяха измерени на HP-6890 Series GC система (Hewlett Packard), свързана с Agilent Mass Selective Detector 5973 (Agilent) и Agilent Autosampler 7683. Използвахме капилярна колона VF ‐ 5MS (30 m × 0,25 mm вътрешен диаметър; Varian Technologies) със силилирана предколона (5 m). След качествения анализ на метаболитите (спектри, адаптирани към базата данни NIST), установихме параметри за мониториране на единични йони и ги използвахме за количествено определяне на глюкоза, BHB, цитрат, сукцинат, фумарат и малат. Изчисленията са извършени с вътрешни и външни стандартни методи.

Статистически анализ

Стойностите се изразяват като средна стойност ± SD от n експерименти. Статистическата значимост между лечебните групи беше оценена чрез еднопосочен ANOVA с пост-тест на Tukey, като се използва софтуер GraphPad Prism версия 5.0.

Резултати

Ефекти на богатите на мазнини диети върху енергийните метаболити и образуването на кетонни органи по време на мозъчна исхемия

В първия експеримент от нашето проучване сравнихме 2 диети, богати на мазнини, богатата на трихептаноин диета и диетата със соево масло, със стандартната диета. Въпреки че съдържанието на мазнини в 2-те богати на мазнини диети е идентично по отношение на калориите, трябва да се отбележи, че соевото масло има високо количество C16/18 мастни киселини, докато трихептаноинът се състои от глицерол, естерифициран до C7-хептанова киселина. Микродиализата е извършена преди, по време и след исхемия. Данните (Фигура 1) показват, че, както е описано по-рано, 14 мозъчна исхемия е довела до бърз спад в мозъчната глюкоза и значително увеличение на лактата във всичките 3 диетични групи. Нивата на глюкоза и лактат се нормализират по време на реперфузия, като мишките на диетата със соево масло показват по-малко бързо възстановяване на лактата в сравнение с другите 2 диетични групи (Фигура 1А и 1В). Обратното се наблюдава за глюкозата (Фигура 1А и 1В). Интересното е обаче, че се наблюдава значително ≈5-кратно покачване на BHB при 2-те диетични групи при богати на мазнини диети (Фигура 1C) и също се нормализира по време на реперфузия. Не се наблюдава значително увеличение на BHB при мишки на стандартната диета (Фигура 1С).

В следващите експерименти се измерват нивата на метаболит в черния дроб, кръвната плазма и хомогенатите на мозъчната исхемична хемисфера. Открихме, че исхемичният инсулт предизвиква масивно образуване на кетонни тела в черния дроб (Фигура 2А), органът, отговорен главно за кетогенезата. В черния дроб на мишки, хранени с трихептаноин, BHB се повишава от базово ниво от 181 ± 97 до 2031 ± 787 μmol/L по време на мозъчна исхемия, 11-кратно увеличение. В групата, хранена със соево масло, BHB се повишава от 258 ± 46 на 3.688 ± 1179 μmol/L, което е 14-кратно увеличение. За сравнение, това огромно увеличение не се наблюдава при мишки, хранени със стандартната диета. Въпреки че нивото на BHB в черния дроб се е повишило> 2 пъти (от 406 ± 108 на 1095 ± 525 μmol/L) при тези мишки, това увеличение не е статистически значимо (Фигура 2А).

Едновременно с образуването на кетонно тяло в черния дроб, плазмените концентрации на BHB се повишават от 187 ± 69 на 641 ± 203 μmol/L при мишки, хранени с трихептаноин и съответно от 61 ± 42 до 924 ± 565 μmol/L в мишки, хранени със соево масло, съответно; отново, мишките на стандартната диета показаха много по-малко забележимо увеличение (от 124 ± 46 на 261 ± 152 μmol/L) след преходна оклузия на средната церебрална артерия. И накрая, нарастването на BHB се отразява и в мозъчните хомогенати: базалните нива са 134 ± 90 μmol/L при хранени с трихептаноин и 105 ± 33 μmol/L при мишки, хранени със соево масло, докато по време на исхемия стойностите се увеличават до 1207 ± 380 и 1387 ± 561 μmol/L, съответно. Нивата на BHB не се променят значително при мишки на стандартната диета (Фигура 2). Тези данни показват, че исхемията в мозъка причинява драматична кетогенеза в черния дроб, което от своя страна води до неколкократно увеличение на BHB в кръвната плазма и мозъка. Тази кетогенеза се проявява само при мишки, които преди това са били хранени с диета с трихептаноин или със соево масло, а не със стандартната диета, базирана на въглехидрати.

Влияние на мозъчната исхемия върху енергийния метаболизъм: Сравнение на стандартната диета и диетата със соево масло

Фигура 3 обобщава данните за нивата на глюкоза в черния дроб, плазмата и мозъка. Установихме, че концентрацията на глюкоза в черния дроб е била 2 пъти по-висока след стандартната диета в сравнение с диетичната група със соево масло (P 18, 19, 20 Кетогенеза (образуване на BHB) се проявява до голяма степен в черния дроб и представлява физиологичен отговор, предизвикан например от гладуване. 21 Основното откритие на нашето проучване е, че мозъчната исхемия, предизвикана от запушване на средната церебрална артерия при мишки, причинява масивно образуване на кетонни тела в черния дроб, последвано от повишаване на BHB в мозъка. Този ефект зависи от диетата и се проявява до голяма степен само при мишки, хранени с богата на мазнини диета.

В първата част на проучването сравнихме стандартната диета с 2 богати на мазнини диети, диета със соево масло и богата на трихептаноин диета; и в двата случая съдържанието на мазнини представлява 35% от общите калории. За разлика от предишните ни открития при строго кетогенна диета, 22 тези диети не са причинявали сами по себе си голяма кетоза (Фигури 1 и 2), но са улеснили системната кетоза, когато е била предизвикана мозъчна исхемия. Нашите данни за микродиализа показват, че при богата на мазнини диета мозъчната исхемия води до неколкократно увеличение на BHB в мозъчното извънклетъчно пространство, докато след стандартната диета не се наблюдава увеличение. Известно е, че BHB е пропусклив за мозъка и навлиза в мозъка в зависимост от плазмените му нива. 23 По-подробен анализ на нивата на BHB демонстрира> 10 пъти повишена концентрация на BHB (достигаща 2–4 mmol/L) в черния дроб на мишки при богата на мазнини диета, измерена след 90 минути преходна мозъчна исхемия. Мишките на стандартната диета реагираха с незначително ≈2-кратно образуване на BHB (Фигура 2). Едновременно с богати на мазнини диети нивата на BHB бяха високи както в кръвната плазма, така и в мозъчния хомогенат (≈1 mmol/L).

Общоприето е, че черният дроб е преобладаващото място за производство на кетонни организми, докато други органи, включително глиални клетки в мозъка, могат да образуват малки количества BHB. 4, 24 Кетонното образуване на тялото обикновено се наблюдава при ниски нива на глюкоза, когато са необходими алтернативни субстрати за разход на гориво. В нашите ръце нивата на BHB и глюкозата бяха променени по обратен начин след инсулт (Фигури 2 и 3). След инсулт, плазмените нива на глюкоза са силно намалени, докато BHB е висок. Нивата на чернодробната глюкоза остават високи, но това отчасти може да се дължи на засилено разграждане на гликоген, което не е измерено в нашето проучване. По същия начин нивата на глюкоза в мозъка спадат, когато нивата на BHB се повишат. Когато беше разрешена реперфузия, нивата на BHB в мозъка достигнаха нормални нива в рамките на 1 час, докато концентрациите на глюкоза се повишиха над нормалните нива (реактивна хипергликемия) (Фигура 4). Взети заедно, инсултът индуцира хипогликемичен отговор, придружен от чернодробна продукция на BHB и поемане на BHB в мозъка, отразено от повишените екстра- и вътреклетъчни концентрации на BHB.