Д-р Розмари Е. Шманд

тегло

Отделение по гинекологична онкология и репродуктивна медицина, отдел 1362

Университет на Тексас, MD Anderson Cancer Center, пощенска кутия 301439

Хюстън, Тексас 77230-1439 (САЩ)

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Ракът на ендометриума (ЕК) е най-често срещаното гинекологично злокачествено заболяване в САЩ, като през 2014 г. са диагностицирани 52 630 нови случая [1]. Ендометриалните тумори традиционно се класифицират в два типа [2,3,4]. Тип I или ендометриоидните ендометриални карциноми, които представляват повече от 80% от всички случаи на ЕС, са свързани със затлъстяване, хиперинсулинемия и продължително излагане на непротивопоставен естроген. Смята се, че тези тумори възникват от прогресията на ендометриалната хиперплазия (EH) до сложна атипична хиперплазия до добре диференцирани ендометриални карциноми (EC). Тип II или неендометриоидни ендометриални карциноми, включват маточни серозни карциноми и обикновено са по-агресивни и не зависими от естрогена. Наскоро, въз основа на обширни геномни анализи както на тумори тип I, така и на тип II, ECs бяха допълнително прекласифицирани в множество подтипове [2,5,6,7,8]. Всъщност, подробното характеризиране на молекулярните промени, залегнали в основата на патогенезата на различните хистологии на ЕС, поставя основите за рационални стратегии за профилактика на заболяванията и терапевтичен дизайн на лекарства [2,5,6,7,8].

Най-често наблюдаваните генетични мутации в тип I EC се наблюдават в гена на супресор на фосфатаза и тензин хомолог (PTEN). Смята се, че мутацията на PTEN е ранно събитие в патогенезата на ЕК и честотата му нараства с прогресирането на заболяването [9]. До 20% от случаите на EH пристанищни мутации в PTEN, докато над 80% от EC тип I притежават инактивиращи мутации в PTEN [10]. PTEN действа едновременно като протеин и като липидна фосфатаза [11,12]. Той за предпочитане дефосфорилира фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфат (PIP3), като по този начин действа в противоположност на фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат 3-киназата (PI3K). Мутациите, водещи до загуба на функция или експресия на протеина PTEN, са свързани с хиперактивност на пътя PI3K/AKT/mTOR, като по този начин се увеличава клетъчната пролиферация и оцеляване, метастази и ангиогенеза, промени в метаболизма и резистентност към химиотерапевтични агенти [11,12, 13].

Генетично модифицираните PTEN „нокаутиращи“ мишки представляват добре характеризиран животински модел за изследване на прогресията на EH до тип I EC. Без да се провалят, всички женски мишки, хетерозиготни за инактивиране на мутации в PTEN, развиват EH до 26-седмична възраст, като 20% от мишките прогресират до нисък клас EC до 40 седмици [14,15,16]. Този ефект се наблюдава при модели на мишки със системно хетерозиготно разрушаване на PTEN (PTEN +/-) и при модели, насочени към хетерозиготно разрушаване на ендометриума, използвайки система Cre-Lox (PR Cre/+ PTEN flox/+). По-рано демонстрирахме, че еверолимус (RAD001), mTOR инхибитор, предотвратява прогресията на EH при тези животни [17], което показва, че този животински модел може да бъде полезен за изследване на химиопрофилактиката на EH.

Затлъстяването значително увеличава риска от ЕК [3]. Американският институт за изследване на рака изчислява, че 59% от ЕС могат да бъдат предотвратени чрез поддържане на здравословно тегло и чрез физическа активност [18]. PR Cre/+ PTEN флокс/+ мишки, отгледани на фон C57BL/6, са податливи на диета, индуцирано затлъстяване, с придружаваща лека до умерена хипергликемия и хиперинсулинемия, които имитират човешкото състояние [19,20,21]. Като се има предвид ролята на затлъстяването в риска от тип 1 на ЕС, ние се опитахме да определим дали затлъстяването ще ускори появата на EH и прогресирането му до EC в PR Cre/+ PTEN флокс/+ модел на мишка.

Наскоро беше доказано, че метформинът, бигуанидно лекарство, често използвано за лечение на диабет тип 2, оказва инхибиращи растежа ефекти при различни видове рак, включително EC in vitro и in vivo [22,23,24,25]. Неотдавнашни проучвания от нашата собствена група демонстрират реакция на ендометриума към терапия с метформин при модел на плъхове [24,26]. Метформин намалява клетъчната пролиферация по множество механизми. Метформин повишава чувствителността на инсулиновите рецептори и намалява нивата на циркулиращия инсулин, като по този начин модулира растежа, медииран от инсулиновите рецептори. Метформин също така активира инхибиторния на растежа AMP-зависима киназа (AMPK), който противодейства на сигнализирането както по PI3K/AKT, така и по MAPK пътища надолу по веригата на различни рецептори на растежен фактор [22,27]. Следователно, в допълнение към изследването на ефектите от затлъстяването върху патогенезата на ЕХ, ние допълнително проучихме дали метформин може да действа като химиопрофилактичен агент при PR Cre/+ PTEN флокс/+ мишки, независимо дали са слаби или затлъстели.

Материали и методи

Животни

Точкуване за EH

Имунохистохимично оцветяване на тъкани на ендометриума

Ефектът на затлъстяването и метформин върху пролиферацията на ендометриума на мишки се оценява във фиксирана с формалин, вградена в парафин тъкан чрез оцветяване с Ki67 (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния, САЩ), следвайки инструкциите на производителя. Степента на апоптоза в ендометриалните тъкани се определя чрез оцветяване с имунохистохимия (IHC) за разцепена каспаза-3 (Asp175; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Секциите бяха оцветени с хематоксилин на Mayer. Средният брой положително оцветени клетки Ki67 или каспаза-3 в 5-10 микроскопични полета с висока мощност се отчита на слайд и се изчислява като: 200 × (брой положително оцветени ендометриални клетки/общо ендометриални клетки). Тъканите също бяха оцветени за сигнали за инсулин и IGF-1 рецептор надолу по веригата, включително фосфо-S6 рибозомен протеин (Ser235/236), фосфо-AKT (Ser473), фосфо-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) и фосфо- ацетил-КоА карбоксилаза (Ser79) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) и се оценява съгласно предварително публикувани процедури [24].

Серумни анализи

Нивата на адипонектин в серума се оценяват с помощта на комплекта ELISA за мишка адипонектин (Millipore, Billerica, МА, САЩ). Серумни проби се тестват в три екземпляра.

Статистически анализ

За всеки от следните тъканни и серумни маркери: Ki67, pS6rp (фосфо-S6 рибозомен протеин), pACC (фосфо-ацетил-КоА карбоксилаза), каспаза 3, pERK (фосфо-p44/42 ERK), pAKT (фосфо-AKT) и адипонектин се изчислява еднопосочен дисперсионен анализ. Тестът на Dunnett е използван за провеждане на post hoc сравнения на LFD групата (контрола) с експерименталните групи (диета и метформин). Всички тестове бяха двустранни и p Cre /+ PTEN флокс /+ Мишки

Хистологичните резултати между лекуваните групи и контролната група не се различават статистически (фиг. 1; таблица 1). Средните резултати от хиперплазия бяха 4.7, 5.9, 5.9 и 6.1 за контролни слаби мишки, затлъстели мишки и лекувани с метформин сухи и затлъстели мишки, като по-голямата част от мишките се представиха с хиперплазия от степен 2, както е определена от нашата система за оценка на 26 седмици, независимо от групата на лечението. Ефектът на метформин и диета/затлъстяване върху пролиферацията на ендометриума беше сравнен, използвайки IHC оцветяване за Ki67. Въпреки значителна разлика в теглото в групите с HFD спрямо LFD (фиг. 1а), не са наблюдавани значителни разлики в ЕН на 26 седмици (фиг. 1б). Освен това, метформин не води до значителни промени в теглото на животните или върху развитието на ЕН при затлъстели или слаби животни. Взети заедно, не се наблюдава значителна разлика в резултата от хиперплазия или пролиферацията на ендометриума между никоя от четирите лечебни групи (фиг. 1; таблица 1).

маса 1

Ефектите на затлъстяването и метформин върху степента на ендометриална хиперплазия и пролиферативно сигнализиране при затлъстели и слаби PR Cre/+ PTEN f/f мишки

Фиг. 1

Лечението на затлъстяване и метформин нямат забележим ефект върху степента на EH в PR Cre/+ PTEN флокс/+ модел на мишка. а PR Cre/+ PTEN флокс/+ мишки бяха хранени или с HFD, или с LFD, или необработени, или третирани с метформин (1000 mg/kg) в питейна вода. Животните бяха претеглени и евтаназирани на 26 седмици. Серумът и репродуктивните органи бяха събрани за анализ. Теглото на мишките, хранени с LFD, третирани или нетретирани с метформин, са значително по-ниски от тези при мишки, хранени с HFD. Няма значителни промени в теглото в отговор на метформин нито при животни, хранени с HFD, нито с LFD. б Ендометриалната тъкан се оценява за наличие на хиперплазия след оцветяване с НЕ, а клетъчната пролиферация се анализира чрез IHC оцветяване за Ki67. ° С Не се наблюдава значителна разлика в клетъчната пролиферация между лекуваните групи, както се определя от процента на Ki67-положителни клетки в ендометриума.

Маркерите на клетъчната пролиферация и сигнализирането за инсулин/IGF-1 не се влияят нито от индуцирано затлъстяване, нито от метформин в ендометриума на PR Cre /+ PTEN флокс /+ Мишки

Промените в сигналните пътища, обикновено засегнати от затлъстяване и метформин, се оценяват в ендометриума чрез IHC оцветяване, използвайки специфични за активирането антитела. Констатациите са обобщени в таблица 1. Не са наблюдавани значителни разлики в оценките на IHC за оцветяване за pS6rp (Ser235/236), pAKT (Ser473), pERK (Thr202/Tyr204) и pACC (Ser79) между тъканите на ендометриума на която и да е от трите третирани групи в сравнение с контролната група с LFD. Освен това не са наблюдавани разлики в апоптозата, измерени чрез оцветяване с каспаза 3 IHC, между контролни слаби мишки, мишки със затлъстяване и третирани с метформин слаби и затлъстели мишки.

Метформин потиска експресията на адипонектин при затлъстяване и постно PR Cre /+ PTEN флокс /+ Мишки

Неотдавнашни проучвания от нашата група демонстрират реакция на ендометриума към терапия с метформин при модел на плъх [24]. Очевидната липса на ефект върху сигналната трансдукция в ендометриума на PR Cre/+ PTEN flox/+ мишки ни накара да проучим дали този животински модел е системно устойчив на ефектите на метформин.

Нивата на инсулин не могат да се използват като маркер за отговор на метформин, тъй като животните в това проучване не са гладували; обаче, Huypens et al. [32] наблюдава, че метформин намалява експресията на експресията на адипонектин и освобождаването в адипоцитите на мишка (3T3-L1). Поради това тествахме серумните нива на адипонектин като сурогатен маркер на отговор на метформин (таблица 1). В сравнение с контролните слаби мишки (14,5 ng/ml), нивата на адипонектин намаляват значително при лечение с метформин както при слаби (10,5 ng/ml, p = 0,002), така и при затлъстели (10,9 ng/ml, p = 0,007) мишки. Тези открития потвърждават, че PR Cre/+ PTEN флокс/+ мишки имат системен отговор на метформин, въпреки очевидната липса на отговор на това лекарство в ендометриалната тъкан.

Дискусия

Инактивиращите мутации в гена на супресор на тумора PTEN, обикновено се наблюдават при тип I EC и се смята, че представляват ранно събитие в патогенезата на това заболяване. В подкрепа на тази хипотеза 100% от женските мишки, хетерозиготни за инактивиращи мутации в PTEN, развиват EH до 26-седмична възраст, като 20% от тези мишки напредват до степен 1 ​​EC до 40-седмична възраст. Нашите предишни проучвания демонстрират, че хетерозиготни мишки PTEN представляват полезен модел за предклинична оценка на химиотерапевтични лекарства, като еверолимус, които могат да предотвратят прогресията от EH към EC. Констатациите, представени в настоящото проучване, обаче предполагат, че този модел може да бъде по-малко полезен при оценката на поведенчески терапии, като диета и упражнения, или лекарства като метформин, които имат за цел да предотвратят или обърнат най-ранната трансформация от нормална в хиперпластичен ендометриум.

В модела PR Cre/+ PTEN flox/+ на мишки, индуцираното от диетата затлъстяване не повишава степента на EH в сравнение с слаби животни, хранени с LFD. Няма значителна разлика в оцветяването с Ki67, което е тъканен маркер за пролиферация. Сигнализирането през PI3K/AKT и MAPK пътищата не се влияе от затлъстяването в ендометриалната тъкан, притежаваща генетична мутация на PTEN. Освен това, въпреки че повлиява системните нива на адипонектин, антидиабетното лекарство метформин няма видим ефект върху ЕН нито при затлъстели, нито при слаби PR Cre/+ PTEN флокс/+ мишки. Взети заедно, тези данни предполагат, че генетично придобита PTEN мутация в ендометриума е била достатъчна, за да стимулира развитието на EH и че тези лезии са устойчиви на ефектите от затлъстяването и метформин.

Заключваме, че макар моделът на PTEN за хетерозиготна нокаут да остане полезен за предклиничната оценка на интервенциите за свързана с болестта на Cowden ЕК и за лечение на спорадични EC, причинени от мутации на PTEN, той не е подходящ за всички изследвания, насочени към химиопрофилактиката на ранната EC.

Благодарности

Благодарим на д-р Франко ДеМайо за използването на неговия PR Cre/+ PTEN флокс/+ миши модел на рак на ендометриума. Също така благодарим на д-р Ръсел Бродус за неговото съдействие при оценката на ендометриалната хиперплазия при нашите мишки. Този проект беше подкрепен отчасти от номер на безвъзмездна помощ P50CA098258 от Националния институт по рака, а също така отчасти от Националните здравни институти чрез гранта за подкрепа на Центъра за борба с рака на MD Anderson CA016672. Тази статия е посветена на паметта на д-р Майк Милам, чиито изследвания, използващи PTEN модела на ендометриална хиперплазия, продължават да подхранват текущите изследвания в нашата лаборатория.

Декларация за оповестяване

Авторите съобщават, че няма конфликт на интереси.