• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Съобщено от Чарлз Дж. Арнтцен, Държавен университет в Аризона, Темпе, Аризона, 13 декември 2008 г. (получено за преглед на 15 октомври 2008 г.)

чревна

Свързана статия

Резюме

Много предишни проучвания, изследващи разнообразието на човешката чревна микробиота, са разчитали на генерирането на клонирани библиотеки на гена 16S rRNA, последвано от секвениране по метода на Sanger. Използвайки тази методология, нито едно от най-големите изследвания на микробното разнообразие на човешките черва до момента не е взело проби от над 20 000 бактериални секвенции (6, 10, 11). Непараметричните оценки и екстраполациите от колекторните криви прогнозират, че получаването на много по-голям брой последователности може да разкрие до 500–15 000 вида (10, 11), които включват относително редки членове на микробната общност, които заедно могат да имат дълбоко въздействие върху здравето на червата и заболявания, включително затлъстяване. Пиросеквенирането, метод за секвениране чрез синтез, може да постигне много по-висока производителност или брой последователности, необходими за разкриване на пълното разнообразие на чревната микробна общност на по-ниска цена от метода на Сангер (12). Пиросеквенцията се използва успешно за изследване на микробната общност при животни (2), хора (13, 14), почви (15) и океани (16).

В настоящото проучване използвахме традиционните методи за Sanger и високопроизводителните 454 пиросеквениращи методи, за да анализираме микробиотата на човешките черва при 9 индивида, по 3 във всяка от категориите с нормално тегло, болестно затлъстяване и пост-стомашна байпас хирургия. Нашите цели бяха да идентифицираме специфични микробни линии, които могат да играят важна роля в развитието на затлъстяване, както и да определим дали наличието или изобилието на тези микроорганизми се променя след успешен RYGB. Използвайки 454 пиросеквениране, успяхме да анализираме 184 094 16S рРНК генни последователности на човешката чревна бактериална общност от 9 индивида. Ние също така определихме количеството на бактериите и археите, използвайки количествена PCR в реално време (QPCR). Доколкото ни е известно, това е първият доклад от молекулярно изследване на чревната микробиота след хирургична процедура за отслабване, в случая RYGB.

Резултати

Характеристики на предмета.

Проучихме проби от изпражнения от 9 субекта, по 3 в 3 групи: нормално тегло (nw), затлъстяване (ob) и пост-стомашен байпас (gb). Двама от 3-те субекта във всяка група бяха жени. Средната (± SD) възраст на субекта е сходна в 3-те групи (nw, 36,7 ± 4,0 години; ob, 35,7 ± 4,2 години; gb, 43,3 ± 8,1 години). Средният индекс на телесна маса (ИТМ) е 22,7 ± 2,3 kg/m 2 в групата nw, 48,3 ± 7,7 kg/m 2 в групата ob и 27,7 ± 4,1 kg/m 2 в групата gb. Средният предоперативен ИТМ в групата на gb е 40,6 ± 5,4 kg/m 2, а средната загуба на тегло след RYGB е 40,7 ± 5,9 kg. Проби от изпражнения се събират между 8 и 15 месеца след RYGB при 3 gb субекти; към този момент загубата на тегло е спряла при 1 от пациентите, докато другите 2 продължават да отслабват.

Микробна общност на човешките черва, разкрита чрез секвениране на Sanger и пиросеквенция с висока производителност.

За да разкрием фините детайли на структурите на микробната общност на човешките черва, проведохме масивно успоредно пиросеквениране върху хиперпроменливия V6 регион на гена 16S rRNA. Използван като „таг“ или „баркод“, регионът V6 е част от гена 16S rRNA с пълна дължина (16). Таблица 1 показва, че повечето от V6 таговете в това проучване са много сходни с референтните последователности. Например, повече от 92% от маркерите са имали съвпадения в референтната база данни с разстояние, по-малко от 0,05, или 95% сходство, а останалите (8%) са имали съвпадения с разстояние 0,06–0,14. По време на таксономични задания открихме, че хиперпроменливият V6 маркер може да съвпада с множество последователности в референтната база данни с еднакво най-кратко разстояние. В повечето случаи всички мачове имаха еднаква таксономия. В много малко случаи (Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Разпределение на изчислените нуклеотидни разстояния от 4 произволни библиотеки в нашето проучване

Таблица 2 обобщава броя на пиросеквениращите маркери, намерени за всеки от 9-те субекта. Средната дължина на четене на пиросеквениране беше 105 bp (SD = 22 bp). След прилагане на строги критерии за подрязване на последователността за премахване на нискокачествени четения, получихме общо 184 094 висококачествени изрязани четения, или 92,1% от суровите четения. Последователността на етикетите за всеки индивид варира от 13 963 до 31 835, със средно 20 455. Междинните суми на етикетите, получени във всяка тегловна група, са сравними (nw, 56 600; ob, 61 916; gb, 59 016). Таблица 2 също така показва, че 419–575 филотипа са получени от пиросеквениращи маркери на 9-те субекта. Тук филотиповете се определят като отделни, коригирани с подравняване с множество последователности най-добри съвпадения с референтната база данни V6 V6RefDB. Нашите наблюдения върху филотипа се съгласяват добре с предишно предсказване на поне 500 филотипа в човешките черва (10).

Обобщение на данните за пиросеквениране и филотипове с висока производителност

Таксономично разграждане на чревни бактериални V6 тагове, получени чрез пиросеквениране при субекти с нормално тегло (nw1, nw2 и nw3), затлъстели (ob1, ob2 и ob3) и пост-стомашен байпас (gb1, gb2 и gb3).

Бактериални семейства, обогатени в ob и gb групите. (A) Значителен (P 10; пиросеквениращи маркери> 100). Точките с данни, разположени по оста x, са редки таксони, пропуснати от последователността на Sanger, но уловени от пиросеквенирането с по-висока производителност.

Корелация на предвидените таксономични задания на последователността на Sanger и пиросеквениране. Броят на последователностите в рамките на таксон от последователности с пълна дължина се нанася срещу броя на маркерите от същия таксон, използвайки пиросеквениране.

Архея и бактерии QPCR.

Използвахме QPCR, за да изброим всички бактерии и археи. Ние също така определихме количеството на метанобактериите, който съдържа хидрогенотрофни метаногени, включително преобладаващия чревен археон на човека Methanobrevibacter smithii. Както е показано на фиг. 4, броят на бактериите в изследваните субекти варира от 1,5 × 10 10 до 1,1 × 10 11 копия на 16S rRNA ген на грам мокро изпражнение. Интригуващо е, че открихме по-голям брой археи в ob групата, отколкото в останалите 2 групи. Средно субектите в ob групата са имали 5,5 × 10 6 копия (n = 3) на 16S рРНК гени на грам изпражнения, в сравнение с неоткриваеми нива в nw групата и 7,5 × 10 3 копия/g само от 1 от 3 субекта (gb1) в групата gb. Изобилието от метанобактерии в изследваните субекти съвпада много добре с това на общите археи, потвърждавайки доминирането на метаногените, консумиращи водород, в човешката чревна археална популация. В проби, приютяващи Archaea (от субекти ob1, ob2 и ob3 и gb1), QPCR не демонстрира усилване с праймери, насочени към метаногенни подгрупи, различни от Methanobacteriales, и PCR-DGGE с археални праймери, открити само една лента (данните не са показани). По този начин нашите резултати показват ниско археално разнообразие в нашите проби.

Броят на бактериите, археите и метанобактериите, измерен количествено чрез QPCR в реално време. Лентите за грешки представляват стандартната грешка на средната стойност (n = 3).

Сравнение на микробни общности от UniFrac.

Фиг. 5 показва клъстерите, базирани на метриките на UniFrac. Най-важната констатация е, че тримата субекти в групата от Нова Запад са образували клъстер, много различен от групата ob, което показва, че те приютяват различни микробни общности. Двама от 3-те субекта в групата на gb образуват свой собствен клъстер.

Групиране на човешки чревни микробни общности в 3 тестови групи (nw, ob и gb), на базата на непретегления UniFrac анализ на филогенетичното дърво, показан на фиг. S1. Дължината на разклонението представлява разстоянието между средите в единици UniFrac, както е посочено от лентата на мащаба. Броят на ножовете се базира на 100 повторения и са показани само стойности> 50.

Видово богатство, разкрито от 16S rDNA V6 пиросеквенция.

Таблица S1 показва голямото видово богатство в човешките чревни микробни съобщества. Непараметричните оценители Chao1 и ACE (базирано на изобилие оценка на покритието) (22, 23) проектират общо 1 206–2 217 бактериални оперативни таксономични единици (OTU). Допълнително вземане на проби ще бъде необходимо, за да се улови разликата между наблюдавания брой OTU и оценките Chao1 или ACE, както е показано от кривите на разреждане (фиг. S2) въз основа на най-добрите съвпадения във V6refDB. Тъй като различните маркери за пиросеквенция могат да съвпадат с една и съща референтна последователност във V6refDB, кривите на разреждане, базирани на групирания с най-добро съвпадение, могат да подценят богатството на видовете. Един от начините да се преодолее това е да се групират маркери за последователност в OTU на определени разстояния (например 0,03, 0,06, 0,09). Фиг. S3 показва кривата на натрупване на видове на проба nw1 с помощта на програмата DOTUR. Ясно е, че дори след вземане на проби от 31 835 последователности, броят на OTU продължава да нараства с 3% (ниво на видовете) или 6% (ниво на рода). Това наблюдение изисква допълнително вземане на проби, за да се определи истинското микробно разнообразие в микробната общност на човешкото черво.

Дискусия

В това проучване ние разпитахме генетичното разнообразие на микробната общност на човешкото черво във връзка със заболяване (затлъстяване) и хирургическа процедура за отслабване (RYGB), използвайки независими от културата молекулярни филогенетични и екологични статистически методи. Нашите резултати са забележителни със следното: (i) Затлъстелите индивиди имат значително различни чревни общности от индивидите с нормално тегло и (ii) RYGB променя чревната микробна общност по уникален начин.

Предишно проучване за загуба на тегло при 12 пациенти със затлъстяване установява увеличение на фракцията на Bacteroidetes спрямо изходното ниво на всеки субект (6). Не проучихме надлъжния ефект върху чревната микробиота, свързан със загуба на тегло от индивиди. Открихме малко повече Bacteroidetes при затлъстели индивиди, отколкото при индивиди с нормално тегло, но разликата не беше значителна. Но нашите резултати ясно показват, че Prevotellaceae, подгрупа от Bacteroidetes, е значително обогатена при затлъстелите индивиди. Ley et al. (6) не отчита промяна в подгрупите в Bacteroidetes. Възможно е загубата на тегло да повлияе на тези подгрупи по различен начин, причинявайки увеличаване на една подгрупа, докато друга намалява. Диетата също може да помогне да се обяснят очевидно различните резултати. Тестовите субекти в изследването на Ley et al. (6) са били на диета с ограничено съдържание на мазнини или въглехидрати, докато ние не сме ограничавали диетичните компоненти в нашите тествани субекти. Неотдавнашно проучване не установи разлика между фракцията на Bacteroidetes при лица със затлъстяване и лица, страдащи от затлъстяване (26), в съгласие с нашите резултати. Същото проучване също не съобщава за значителна промяна в относителното изобилие на Bacteroidetes при затлъстели лица на диета за отслабване.

За да сведем до минимум ефекта от антибиотиците върху промените в микробния състав, ние нарочно избрахме пациенти със стомашен байпас, които не са приемали никакви антибиотици в рамките на 3 месеца преди събирането на проба от изпражненията. Предишни проучвания показват, че доминиращата човешка микробиота е устойчива на антибиотично лечение и съставът на микробната общност обикновено се връща в предлекарствено състояние след 30 дни (27). Друго скорошно проучване установи, че микробният състав при 3 индивида, които са получили 5-дневен курс на ципрофлоксацин, много прилича на този, открит преди лечението до 4 седмици след предизвикването на лекарството (14). Въпреки че нашите констатации отразяват изместването в общността за една точка от времето след операцията, точката от време съвпада с драматична загуба на тегло. Необходими са повече разследвания, включващи повече изследвани лица и временни проби преди и след операцията, за да се получи по-голяма представа за участващите механизми и причинно-следствената връзка между затлъстяването, загубата на тегло, чревната микробиота и влиянието на диетичните промени след стомашен байпас хирургия.

Обобщена хипотеза и последици.

Нашите резултати разширяват констатациите на други, като демонстрират, че затлъстелите индивиди приютяват уникални H2-продуциращи бактериални групи, особено членове на семейство Prevotellaceae и някои групи в Firmicutes. Тези H2-продуциращи бактерии съжителстват в стомашно-чревните пътища на затлъстели индивиди с относително висок брой H2-окисляващи метаногенни Archaea. Метаногените могат да съдържат до 10% от всички анаероби в дебелото черво. Възможно е да са по-склонни да обитават епителни биофилми, отколкото изпражнения, поради по-бавния им темп на растеж (25). От друга страна, животът по-близо до чревния епител може да изложи строго анаеробните метаногени на по-окисляваща среда. Необходим е анализ на проби от биопсия на лигавицата на дебелото черво, за да се отговори на въпроса дали пропорциите на метаногени са по-високи в лигавичните биофилми, отколкото в пробите на изпражненията. Този анализ също ще бъде полезен при определяне дали по-голям брой H2-продуциращи бактерии обитават лигавичния слой на червата. Предишни проучвания са установили различен бактериален състав в проби от лигавица и изпражнения (10), а лигавичните бактерии изпълняват полезни функции, включително повишаване на абсорбцията на хранителни вещества, индуциране на имунитета на гостоприемника и модифициране на експресията на гена на гостоприемника.

Растителните полизахариди и хранителните влакна се ферментират от чревни бактерии с производството на SCFA, включително формиат, ацетат, пропионат, бутират и лактат. Увеличението на метаногенезата, окисляваща H2, улеснява ферментацията, която произвежда повече SCFA. Форматът също може да се използва директно от хидрогенотрофни метаногени. Пропионат, бутират и лактат могат да се ферментират до ацетат и Н2, последният от които се използва от хидрогенотрофни метаногени. Следователно, увеличаването на Н2-окисляващата метаногенеза трябва да увеличи превръщането на растителните полизахариди в SCFA, особено ацетат. Нашите открития имат ясна връзка с енергийната хомеостаза при хората, тъй като SCFAs, произведени от ферментативните бактерии, се поемат през епитела на човешкото черво, докато H2 е добре известен фактор за енергиен обмен в микробните общности (31).

Откритията ни водят до следната хипотеза относно междувидовия пренос на Н2 между бактериални и археални видове и как той влияе върху усвояването на енергия от хората. Бързото поглъщане на H2 от метаногените ускорява ферментацията на растителни полизахариди и други въглехидрати от ферментатори, произвеждащи H2, като Prevotellaceae. Ускорената ферментация стимулира хидролизата на обикновено несмилаеми органични вещества и води до повишено производство на ацетат, който се абсорбира от човешките черва.

Материали и методи

Човешки субекти и вземане на проби от изпражнения.

Проучихме 9 несвързани хора без настоящи стомашно-чревни симптоми или анамнеза за хронични стомашно-чревни проблеми, разделени в 3 групи: 3 индивида с нормално тегло (субекти nw1, nw2 и nw3; ИТМ, 20-25 kg/m 2), 3 болезнено затлъстели индивиди (субекти ob1, ob2 и ob3; ИТМ> 35 kg/m 2) и 3 лица, претърпели RYGB поне 6 месеца по-рано (субекти gb1, gb2 и gb3; предоперативен ИТМ> 35 kg/m 2) . Нито един от хората не е живял в едно домакинство и никой не е получавал никакви антибиотични, пробиотични или пребиотични агенти през 3-месечния период преди събирането на фекални проби. След събирането, пробите от изпражненията бяха замразени при -80 ° C, докато бяха проведени молекулярните анализи. Институционалният съвет за преглед на клиниката Mayo одобри проучването и всички субекти предоставиха писмено информирано съдържание.

Клониране на изграждане на библиотеки, филогенетичен анализ и сравнение на общности от UniFrac.

Изолирахме геномна ДНК от проби от човешки изпражнения (мокро тегло, 0,2 g) с QIAamp DNA Stool Kit (Qiagen), следвайки инструкциите на производителя. Изградихме 16S rDNA клонирани библиотеки с праймери 8f и 1525r (32) и секвенирахме вложките с капилярен секвенсор ABI 3730xl. Поредиците бяха подравнени с NAST (33), импортирани в база данни ARB (greengenes.arb, версия 23, май 2007 г.) и добавени в дървовидна дървесина („tree_all“ със 137 916 референтни последователности с почти пълна дължина) с „LanemaskPH ”Филтър. Възможните разлики в структурите на микробните общности между 3-те изследователски групи бяха изследвани с помощта на непретеглени показатели на UniFrac (5). Конструкцията на библиотеката и дървото е описана по-подробно в SI Материали и методи.

16S rDNA V6 Пиросеквениране и анализ на данни.

Използвахме бактериални праймери 967f и 1046r (16) за амплифициране на V6 региона на гена 16S rRNA. Пимпсеквенирането на ампликон се извършва със стандартни протоколи 454/Roche GS-FLX (12). За анализ на данните модифицирахме методологията, описана от Sogin et al. (16) чрез ограничаване на присвояването на таксономия до тези подравнения, по-дълги от 57 bp; по този начин изключихме много кратки BLAST мачове, които не бяха информативни. Използвахме класификатора 2.0 на проекта Ribosomal Database 2.0 (34), за да присвоим таксономия. За оценка на богатството на видове, базирани на разстояние, ние подравнихме маркерите, използвайки MAFFT, с алгоритъма PartTree (35), изчислихме матрица за разстояние с QuickDist (16) и клъстерирахме последователности в OTU с DOTUR (36). Подробности за анализа на етикетите са описани в SI Материали и методи.

QPCR в реално време.

За количествено определяне на бактерии, археи и археалните подгрупи, ние извършихме 16S rRNA насочен ген QPCR с SYBR-зелено (за бактерии) или TaqMan откриване (за археи, метанобактерии, метаномикробиали и метаносетацеи) (37, 38). Подробности за стандартите и условията на PCR са предоставени в SI Материали и методи.

Благодарности

Благодарим на Джули Хубер за кода QuickDist, Патрик Шлос за насоки относно използването на програмата DOTUR, Дъг Фулър за поддръжка на клъстерни изчисления и Андрю Като Маркус за критичния му преглед на ръкописа. Финансирането на това изследване е осигурено от гранта за сътрудничество в Изследователския университет на Аризона - Клиника Майо.

Бележки под линия

    1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: rittmannasu.edu

Принос на автора: H.Z., J.K.D., B.E.R. и R.K.-B. проектирани изследвания; H.Z., D.K., Y.Y., P.P. и M.D.C. извършиха изследвания; R.W. допринесе с нови реактиви/аналитични инструменти; H.Z., A.Z., M.B., B.E.R. и R.K.-B. анализирани данни; и H.Z., J.K.D., B.E.R. и R.K.-B. написа вестника.

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Депозиране на данни: Последователностите, получени в това проучване, са депозирани в базата данни GenBank (номера на присъединяване FJ452085 – FJ454865).

Безплатно достъпен онлайн чрез опцията PNAS с отворен достъп.