Проф. Дейвид А. Пауър

чувствителният

Отделение по нефрология, болница Остин, Studley Road, Хайделберг 3084,

Виктория (Австралия), тел. (00613) 94965634, факс (613) 94965123

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Свързаната със затлъстяването хипертония (ORH) се характеризира с увеличаване на циркулиращия обем поради задържане на натрий в бъбреците [1]. Животински модели на диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) показват, че започването на хранене с високо съдържание на мазнини (HFD) води до състояние на положителен натриев баланс [2]. След този начален период на задържане на натрий се достига ново стационарно състояние, при което кръвното налягане се повишава, но натриевият баланс се връща към неутрален. Излишъкът от натрий обаче не се екскретира, въпреки повишаването на кръвното налягане, поради нулиране на механизма за натриуреза налягане [1]. Следователно има отделни периоди, в които претоварването с натрий първо се установява и след това се поддържа, въпреки получената хипертония. Въпреки че и двата процеса включват засилена тубулна реабсорбция на натрий [1,3,4], не е известно дали едни и същи тръбни механизми са отговорни за двете фази.

Чувствителният към буметанид котранспортер, NKCC2 и чувствителният към тиазид котранспортер, NCC, са членове на семейството на катион хлорид ко-транспортери. NKCC2 се намира в цикъла на Henle, а NCC се намира в дисталния извит канал. Те са отговорни за реабсорбцията на приблизително 20% и 5-10% от филтрирания натрий, съответно, при базални условия [5]. Чувствителният към амилорид йонен канал, ENaC, се намира в събирателния канал и е отговорен за реабсорбцията на приблизително 3% от филтрирания натрий. Той съществува като хетеротример на α, β и γ подединици [6].

Наскоро демонстрирахме, че след 14 седмици HFD хранене, мишките C57Bl/6 имат повишена активност на NKCC2 поради повишеното фосфорилиране на този котранспортер [7]. Към този момент мишките са установили хипертония. Ние предположихме, че има вероятност да има различни тръбни механизми, участващи по-рано в установяването на ORH, по време на периода на положителен натриев баланс. Следователно в настоящото проучване ние разгледахме профила на най-важните дистални транспортери на натрий при мишки, хранени с HFD в по-ранната точка от 3 седмици, преди началото на хипертонията. По този начин се надявахме да идентифицираме натриевите транспортери, отговорни за установяването на натриево претоварване в отговор на HFD.

Материали и методи

Антитела

Заешки антитела (Ab) pNCCT58 и pNKCC2T96/T101 [8] и pNKCC2S126 [9] са описани по-рано. „T4“ Mouse Ab срещу NKCC1/2 е получено от Развитие на проучванията Hybridoma Bank (Университет на Айова, САЩ). Rabbit Abs срещу α-ENaC, β-ENaC и γ-ENaC са получени от StressMarq Biosciences Inc. (BC, Канада). Rabbit Abs срещу NCC и p (383/325) SPAK/OSR1 са получени от Merck Millipore (Дармщат, Германия). Заешки антитела срещу бета-тубулин са получени от Sigma Aldrich (MO, USA) и pAMPK от Cell Signaling (MA, USA).

Животни

Мишките C57BL/6 се поддържат при специфични условия, свободни от патогени, с 12-часов цикъл светлина/12 часа тъмнина и всички процедури се извършват в съответствие с разпоредбите, определени от Комитета по етика на животните в Остин. Животните получиха безплатен достъп до храна и вода. Диетите с мишки са получени от Speciality Feeds, Западна Австралия. Мишките са били хранени с контролна (5% модифицирана мазнина AIN93G) или с високо съдържание на мазнини (23% мастно модифицирана AIN93G диета (43% енергия от мазнини), с 15% увеличение на NaCl) диета в продължение на 3 седмици. Съдържанието на натриев хлорид в диетата с високо съдържание на мазнини е с 15% по-високо от това на контролната диета, за да съответства на приема на натриев хлорид между групите (по-рано установихме, че мишките ядат приблизително 15% по-малко храна от теглото на HFD).

Теглото на тялото се измерва седмично и при прекратяване. Бъбреците се отстраняват от обезболели животни и се замразяват в течен азот.

Кръвно налягане

Систоличното кръвно налягане се измерва неинвазивно при 11-седмични мишки, които са били на контролна (n = 8) или диета с високо съдържание на мазнини (n = 8) в продължение на 3 седмици, използвайки Life Science (Woodlands, CA, USA) tail- оборудване и софтуер за плетизмография на маншета. Неанестезирани мишки се аклиматизират към техниката за 2 дни преди записите, използвани за анализ. Три последователни отчитания бяха направени за всяка мишка. Мишките, използвани за записване на кръвно налягане, не са били използвани в експерименти за анализ на тъкани.

Western blot анализ

Бъбреците се изрязват бързо и бързо се замразяват в течен азот. Бъбреците (n = 8 на група) бяха нарязани наполовина напречно. Тъканта беше нарязана от горния полюс за приготвяне на кортикални препарати. Долната половина на бъбрека се използва за препарати за „цял бъбрек“ (кора и мозък). Приготвят се лизати, като се използва стъклен хомогенизатор Dounce в буфер за лизис (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 50 mM натриев флуорид, 5 mM натриев пирофосфат, 1 mM натриев ортованадат, 1% (w/v) NP-40, 0,27 М захароза, 0,1% (v/v) 2-меркаптоетанол и коктейл с инхибитор на протеаза (1 таблетка на 10 ml; Roche Diagnostics, Basil, Швейцария). Хомогенатите се центрофугират при 10 000 g в продължение на 15 минути при 4 ° C и протеин концентрация в супернатантите, измерена по метода на Брадфорд (комплект за анализ на протеини Bio-Rad). Хомогенатите се съхраняват при -80 ° C, докато се наложи. Имунопреципитациите за NKCC2 се извършват с използване на Т4 антитяло и равни протеинови концентрации на цели бъбречни лизати от HFD и контрол диетични мишки. Анти-миши IgG-агароза се използва за имунопреципитиране на имунни комплекси (Sigma Aldrich, MO, USA).

Пробите се разделят чрез SDS-PAGE и се прехвърлят електрически в мембрана от поливинилиден дифлуорид (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), използвайки Turbo Transfer System Bio-Rad Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Мембраната се блокира в 10% BSA в Tris-буфериран физиологичен разтвор (TBS) за 1 h и след това се инкубира в първично антитяло. Оптималната концентрация на антитела и продължителността на инкубацията бяха определени за всяко антитяло. След промиване в TBS-0,05% Tween 20, мембраната се инкубира в продължение на 30 минути в конюгирано с FITC вторично антитяло (Dako, Glostrup, Дания). Комплекси на антитела бяха открити с anti-FITC POD (Roche Diagnostics, Basil, Швейцария). Имунореактивните протеини бяха открити чрез засилена хемилуминесценция със системата Western Lightning (PerkinElmer, МА, САЩ). Ако мембраната трябваше да се сондира с друго първично антитяло, съществуващото антитяло, свързано с мембраната, се отстранява чрез инкубация в разтвор за отстраняване на Reblot (Chemicon, MA USA) в продължение на 15 минути. Количественото определяне на Western blots беше извършено чрез денситометрия с анализ, извършен с помощта на софтуера Image J (NIH, Bethesda, MD, USA).

Натриуретични изследвания

За измерване на активността на NCC in vivo, на 11-седмични мишки, които са били на HFD (n = 7) или на контролна диета (n = 5), са прилагани интраперитонеални инжекции от 50 mg/kg хидрохлоротиазид (Sigma Aldrich, MO, САЩ) в 20ml/kg физиологичен разтвор. Мишките се поставят в метаболитни клетки и урината се събира за 3 часа. 3 дни преди това, урината се събира след IP инжекции на равен обем носител (физиологичен разтвор). Концентрациите на натрий, калий и креатинин бяха измерени с помощта на автоанализатор от серия Roche Hitachi Cobas. Съотношенията натрий/креатинин след хидрохлоротиазид са сравнени с изходните нива, за да се получи маркер за относителната in vivo активност на NCC.

Количествена RT-PCR в реално време

Общата РНК се пречиства от цели проби от бъбреци на мишки (n = 8 на група), като се използва реагент TRIzol (Invitrogen) в съответствие с инструкциите на производителя. Качеството и количеството на РНК се определят с помощта на спектрофотометрия и се транскрибират обратно с помощта на комплекта за обратна транскрипция с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR в реално време използва следните праймери: NCC: 5'-CGAGAGTAATCCAGCAGTA-3ʹ и 5ʹ-ATGAAGAGATTAACAAGAACAGAA-3ь и 18S (домакински ген): 5ь-AGTCCCTGCCCTTTGTACACA-3ʹ и 5ʹ-GATCCGAGGGCCTCА. PCR в реално време се извършва на Stratagene MX-3000 с основния микс Solis Biodyne Evagreen (Тарту, Естония), съгласно инструкциите на производителя. Ефективността на грунда беше измерена, като се използва стандартно разреждане, а методът Pfaffl [10] беше използван за изчисляване на относителната експресия. Резултатите се изразяват като гънкава експресия спрямо мишки от див тип, които са получили контролната диета.

Статистика

Статистиката е извършена с помощта на Instat версия 3.05 (GraphPadSoftware, Сан Диего, Калифорния). Данните са представени като средни стойности ± SD. RT-PCR се представя като стандартна грешка на средната стойност. Сравнението на средните стойности от две групи беше извършено чрез несдвоен t-тест. P стойности на