Резюме

ОБЕКТИВЕН-Нашето предишно проучване предполага, че Cidea, член на протеини от семейство Cide, които споделят хомология на последователността с фактора на фрагментация на ДНК и се експресират на високи нива в кафява мастна тъкан, играе важна роля в развитието на затлъстяването. Cideb, друг член на протеините от семейство Cide, е силно експресиран в черния дроб. Бихме искали да разберем физиологичната роля на Cideb в регулирането на енергийния разход и липидния метаболизъм.

индуцираното

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯ -Ние генерирахме Cideb-null мишки чрез хомоложна рекомбинация и след това хранехме мишки от див тип и Cideb-null с високо съдържание на мазнини (58% мазнини). След това характеризирахме индекса на затлъстяване на животните, приема на храна, метаболизма в цялото тяло, морфологията на черния дроб, скоростта на синтез и окисление на мастните киселини, инсулиновата чувствителност и профила на генната експресия.

РЕЗУЛТАТИ—Нулевите мишки на Cideb са имали по-ниски нива на плазмени триглицериди и свободни мастни киселини и са били устойчиви на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини и жива стеатоза. В допълнение, мишките мутантни Cideb показват значително повишена чувствителност към инсулин и повишена скорост на метаболизъм в цялото тяло и окисляване на чернодробните мастни киселини. По-важното е, че мишките Cideb-null показват намалена липогенеза и намалени нива на експресия на ацетил-КоА карбоксилаза, синтаза на мастни киселини и стеарол-КоА десатураза. По-нататък демонстрирахме, че нивата на експресия на свързващия протеин елемент 1c на стерол е значително намален при мишки с дефицит на Cideb.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ—Нашите данни показват, че Cideb е нов важен регулатор в липидния метаболизъм в черния дроб. Cideb може да представлява нова терапевтична цел за лечение на затлъстяване, диабет и чернодробна стеатоза.

  • ACC, ацетил-КоА карбоксилаза
  • НЕТ, кафява мастна тъкан
  • CPT, карнитин-палмитоил трансфераза
  • FAS, синтаза на мастни киселини
  • G6P, глюкоза-6-фосфатаза
  • GTT, тест за глюкозен толеранс
  • IRS, субстрат на инсулиновия рецептор
  • ITT, тест за толерантност към инсулин
  • NEFA, нестерифицирана мастна киселина
  • PGC, активиран от пероксизомен пролифератор γ коактиватор на рецептор
  • PPAR, рецептор, активиран от пероксизомен пролифератор
  • SCD1, стеарол-КоА десатураза 1
  • SREBP1c, белтък, свързващ елемент на стерол отговор, 1c
  • TAG, триацилглицерол
  • WAT, бяла мастна тъкан

Промените в липидната хомеостаза в черния дроб чрез свръхекспресия или генетична мутация на различни фактори често водят до метаболитни дефекти, като затлъстяване, диабет и чернодробна стеатоза. Например, ACC2 -/- мишките имат по-висока степен на окисление на мастните киселини (7) и са устойчиви на затлъстяване и диабет, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини (3). Мишките с дефицит на SCD1, ензим, катализиращ процеса на десатурация на палмитинова киселина до ненаситени мастни киселини, имат повишено окисление на мастните киселини, намалено телесно затлъстяване и повишена чувствителност към инсулин и са устойчиви на индуцирано от диетата затлъстяване и чернодробна стеатоза (8,9). Целевата свръхекспресия на конститутивно активна ядрена форма на SREBP-1c в черния дроб доведе до активиране на набор от целеви гени надолу по веригата и образуване на мастен черен дроб (10).

Cide протеините, включително Cidea, Cideb и Fsp27 (Cidec), споделят хомология с ДНК фрагментационния фактор DFF40/45 в NH2-терминалната област (11). Нашите предишни данни разкриха, че Cidea се експресира при високи нива в кафяви мастни тъкани (BAT) и че мишките с нулево съдържание на Cidea показват по-високи енергийни разходи и засилена липолиза в BAT и са устойчиви на затлъстяване и диабет, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини Наскоро беше показано, че Cidea посредничи при човешкото затлъстяване чрез регулиране на липолизата на човешките адипоцити (13) и е установено, че полиморфизмът на V115F при хора е свързан със затлъстяването в определена популация (14). ИРНК на Cideb бяха открити в различни други тъкани с високи нива на експресия в черния дроб преди това (11); неговата биологична роля обаче е неясна. Когато се свръхекспресират в хетероложни клетки, протеините Cideb могат да образуват хомо-димер и да предизвикат независима от каспаза клетъчна смърт (15). В настоящото проучване генерирахме нокаут мишки Cideb и показахме, че мишките с дефицит на Cideb показват повишен енергиен разход и подобрена чувствителност към инсулин и са устойчиви на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, хиперлипидемия или чернодробна стеатоза. Нашите данни разкриват нов път за контролиране на липогенезата и окисляването на мастните киселини в черния дроб от Cideb.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Поколение на Cideb-null мишки и поддържане на животни.

Процедурите за изолиране на геномни клонинги, генериране на мишки с дефицит на Cideb и рутинно поддържане на щам на мишка бяха по същество същите, както е описано по-рано (12). Животните са били хранени или с нормална диета с чау (5053, диета за гризачи PicoLab 20), или с диета с високо съдържание на мазнини (D12331, 58% от килокалориите от мазнини; Диети за изследване). По време на диетично лечение с високо съдържание на мазнини, 3-седмични мишки са били подложени на диетично хранене с високо съдържание на мазнини в продължение на 19 седмици. За експерименти на гладно и хранене, мишките в групата на гладно са гладували 24 часа, а в групата на хранене са гладували 24 часа и след това са имали достъп до храна и вода в продължение на 12 часа преди анализ (16). Всички изследователски дейности на мишки бяха прегледани и одобрени от комитета за изследване на животни от Университета за наука и технологии в Хонг Конг и Университета Цингхуа.

Southern blot, генотипиране чрез PCR анализ, екстракция на РНК и количествен RT-PCR анализ в реално време.

Геномната ДНК беше изолирана от опашките на мишката и подложена на Southern blot анализ, както беше описано по-рано (17). ДНК фрагментът между местата AvrII и NcoI (фиг. 1С) на геномната ДНК на Cideb бяха използвани като сонда. PCR анализът е използван като рутинен метод за генотипиране. Общата РНК беше изолирана, използвайки реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). СДНК от първата верига са синтезирани от 1 μg обща РНК с олиго- (dT) 20 праймера, като се използва Superscript III RT kit (Invitrogen), съгласно протокола на производителя. PCR в реално време са извършени с ABI SYBR GREEN PCR Master Mix в PCR система MX3000P в реално време (Stratagene) в съответствие с инструкциите на производителя. Резултатите бяха нормализирани до ниво на β-актин във всяка проба. Последователностите на грундовете се предлагат при поискване.

Консумация на кислород в цялото тяло, прием на храна, тест за толерантност към глюкоза/инсулин, индекс на затлъстяване и кръвна химия.

Консумацията на кислород в цялото тяло, съотношението на обмен на дишане, дневният прием на храна, тестовете за толерантност към глюкоза и инсулин (съответно GTT и ITT) и индексът на затлъстяване са извършени, както е описано по-рано (12). За химия на кръвта измерихме серумни нива на триглицериди (TAG), нестерифицирани мастни киселини (NEFA), инсулин, лептин и глюкоза, както беше описано по-рано (12). Използвахме търговски комплект за определяне на серумни нива на кетонни тела (Wako Chemical), адипонектин и резистин (Linco Research).

Western blot анализ, ACC активност и инфузия на инсулин.

Заешко поликлонално антитяло срещу миши Cideb се ​​генерира чрез инжектиране на His-маркиран пресечен протеин Cideb (аминокиселини 1–176) на заек, както е описано по-рано (18). Анализът на Western blot се извършва по същество по същия начин, както е описано по-рано (12). Чернодробните ядрени и мембранни екстракти се приготвят, както е описано по-рано (19). Подробна информация за антителата, използвани за Western blot анализ, е показана в онлайн приложение, което е достъпно на http://dx.doi.org/10.2337/db07–0040. Western blot сигналът е количествено определен от софтуера AlphaEase (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Активността на АСС се определя, като се използва [14 С] бикарбонатен фиксиращ анализ (20). Експеримент с инфузия на инсулин е извършен с помощта на мишки, които са гладували в продължение на 4 часа през порталната вена в продължение на 3 минути, както е описано по-рано (21).

Статистически анализ.

Всички данни са представени като средни стойности ± SE. Разликите между групите се оценяват чрез двустранен, несдвоен или сдвоен тест на Student's t, като се използва софтуерът за статистика Graphpad Prism (Graphpad Software).

РЕЗУЛТАТИ

ИРНК на Cideb е силно обогатена в черния дроб.

За да характеризираме точния модел на разпределение на тъканите на Cideb, ние изолирахме РНК от различни тъкани на мишки от див тип и извършихме полуколичествен PCR анализ. Забелязахме, че Cideb е силно експресиран в черния дроб и в по-малка степен в бъбреците (фиг. 1А). По-ниски нива на експресия на Cideb (поне 50 пъти по-ниски в сравнение с тези в черния дроб) са наблюдавани и в тънките черва и дебелото черво. Не е открита иРНК на Cideb при НДНТ, бяла мастна тъкан (WAT) или скелетни мускули. Western blot анализ с използване на антитела, повдигнати срещу мишки Cideb, допълнително потвърждава, че протеинът Cideb присъства при високи нива в черния дроб и при умерени нива в бъбреците (фиг. 1В).

Поколение на мишки с дефицит на Cideb.

За да изясним физиологичната роля на Cideb, ние изолирахме геномна ДНК на Cideb и генерирахме Cideb-null мишки чрез хомоложна рекомбинация. Стратегията за насочване на гена за нокаут на Cideb е показана на фиг. 1C, тъй като трите COOH-крайни екзона са заменени с устойчив на неомицин ген като положителен селекционен маркер (фиг. 1C). Като късо рамо беше използван фрагмент от 1,6 kb (NcoI-PstI) в 5'-края на геномния локус и фрагмент от 7,2 kb (BamHI-HindIII) от 3 ′ края на геномния локус като дългото рамо . Анализът на Southern blot със сонда, съответстваща на AvrII и NcoI фрагмент, разкрива 5.0-kb фрагмент в мутантни мишки Cideb вместо 3.2-kb фрагмент в мишки от див тип, потвърждавайки, че локусът на Cideb е бил нарушен, както е планирано (фиг. 1D). Както е показано на фиг. 1Е, не е открит протеин на Cideb в мишките с нулев Cideb. Рутинното генотипизиране на Cideb-null мишки се извършва чрез PCR анализ (дизайн и методи на изследване). Тези данни предполагат, че генът на Cideb е бил успешно разрушен и е получена функционално нулева мутация на Cideb.

Мишките с дефицит на Cideb имат слаб фенотип.

Тъй като предишното ни проучване върху Cidea-null мишки демонстрира, че той играе решаваща роля в енергийната хомеостаза, ние изследвахме потенциалната роля на Cideb в регулирането на телесното тегло и индекса на затлъстяване. Когато се хранят с нормална диета с чау, мишките Cideb-null имат телесно тегло, подобно на това на мишки от див тип (Таблица 1). Въпреки това, след 19 седмици диета с високо съдържание на мазнини, телесното тегло на мишките Cideb-null е значително по-ниско от това на мишки от див тип (фиг. 2А; P -/- мишките имат слаб фенотип и са устойчиви на диета). индуцирано затлъстяване.

Мишките с дефицит на Cideb са устойчиви на индуцирана от диетата чернодробна стеатоза.

За по-нататъшно изследване на механизма, лежащ в основата на повишената скорост на окисление на мастните киселини при мутантни мишки на Cideb, ние анализирахме нивата на експресия на ACC2 в чернодробната тъкан на мишки от див тип и Cideb-null, използвайки количествен PCR анализ в реално време. Нивата на мРНК на ACC2 са били с 80 и 60% по-ниски при мишки с нулеви нива при нормално хранене или повторно хранене, съответно (фиг. 4Е). В съгласие с намалените нива на ACC2 иРНК, количеството на ACC2 протеини е по-ниско при мишки с мутант Cideb (Фиг. 4F). Тези данни предполагат, че нивата на експресия на ACC2, отрицателен регулатор на активността на CPT1 и окислението на мастните киселини, са значително намалени при мишки Cideb-null, осигурявайки молекулярно обяснение на повишеното окисление на мастни киселини при мишки Cideb-null.

Мишките с дефицит на Cideb имат повишена инсулинова чувствителност.

Целенасочено нарушаване на Cideb. О: Тъканното разпределение на иРНК на Cideb. Резултатът от количествения PCR анализ в реално време, показващ високи нива на иРНК на Cideb в черния дроб. Останалото е сравнението на нивата на иРНК на Cideb в други тъкани с черния дроб. SM, скелетна мускулатура; SI, тънко черво. B: Резултат от Western blot анализ. Протеинът Cideb се ​​експресира на високо ниво в черния дроб и бъбреците. В: Схематично представяне на стратегията за прекъсване на Cideb: карта на частично ограничение на локуса на Cideb (отгоре), вектор за насочване на гена (средата) и очакваната структура на мутиралия локус (отдолу). Подчертаният регион беше използван като сонда за анализ на Ютърн блот. Р1, Р2 и РЗ представляват праймери, използвани за PCR генотипиране. D: Анализ на Southern blot. Фрагментите от 3,2 и 5,0 kb съответстват на алелите от див тип (+/+) и мутант (-/-) съответно. E: Western blot анализ с използване на чернодробен лизат, генериран от див тип и мутантния черен дроб; Заредени са 100 μg чернодробен лизат. β-тубулинът служи за контрол на натоварването.