Резюме

Въведение

miRNAs са клас малки некодиращи RNAs, които функционират като транслационни репресори чрез директно взаимодействие с тяхната целева mRNA (1,2). miRNAs функционират, за да регулират отрицателно изобилието от специфични протеини и по този начин упражняват контрол върху множество клетъчни и биологични процеси, включително метаболизъм (3,4). Докато miRNAs се транскрибират и оказват много ефекти директно в клетката на произход, miRNAs също се секретират и стабилни miRNAs могат да бъдат открити в плазмата (5). Циркулиращите miRNAs са открити в повечето биофлуиди, включително кръв (серум/плазма), урина, кърма и цереброспинални течности и са защитени от разграждане чрез различни механизми. Част от циркулиращите miRNAs са опаковани в извънклетъчни везикули, като „екзозоми“ (50 - 200 nm мембранно покрити мехурчета) (6–9), които предпазват РНК товара от ендогенна активност на RNase (10). miRNAs също могат да се свързват с различни протеини, включително липопротеини, а именно HDL или аргонаут (AGO) протеини, които са ключовите компоненти на РНК-индуцирания комплекс за заглушаване, за да образуват miRNA-протеинови комплекси за транспорт (10–12). Екзозомите в плазмата/серума са замесени в трансфера на miRNA в целевите клетки и по този начин играят роля в комуникацията между клетките и клетките (11–15).

mir-20b-5p

Наличието на циркулиращи miRNAs подтикна усилията за идентифициране на биомаркери за различни патологии, включително рак, и заболявания, засягащи сърдечно-съдовата, неврологичната, метаболитната и имунната функция (16–22). Специфични циркулиращи miRNAs могат да бъдат полезни биомаркери за диагностициране и лечение на прогресиращи заболявания като диабет тип 2 (23-25). Въпреки факта, че пациентите с диабет тип 2 се характеризират с хипергликемия и повишени нива на HbA1c, тези промени в клиничната химия се откриват едва след настъпване на метаболитен дисбаланс. Дефекти в множество тъкани, контролиращи глюкозната хомеостаза и инсулиновата чувствителност, често са налице години преди диагнозата (26). Като се има предвид сложната патофизиология и тежестта на заболяванията при диабет тип 2, усилията са насочени към идентифициране на циркулиращи miRNA като нови прогностични биомаркери (27–29).

Към днешна дата няма консенсус относно точния характер на циркулиращите биомаркери на miRNA в различни кохорти пациенти с диабет тип 2 и малко е известно относно функционалната (ите) роля (и) на идентифицираните miRNAs в метаболитните процеси, свързани с патогенезата на диабет тип 2. Тук определихме общите серумни и екзозомни профили на експресия на miRNA при мъже с нормален глюкозен толеранс или диабет тип 2 и потвърдихме ефектите на различно изобилните miRNAs върху метаболизма в скелетните мускули.

Изследователски дизайн и методи

Участници в изследването и серумни проби

Изследването е одобрено от комисията по етика на Института Каролинска. Получено е писмено съгласие от всички доброволци. Двадесет мъже с нормален глюкозен толеранс, 16 мъже с нарушен глюкозен толеранс и 21 мъже с диабет тип 2 бяха наети по обява във вестници или от клиника за първична здравна помощ. Участниците с диабет тип 2, нарушен глюкозен толеранс и нормален глюкозен толеранс бяха съпоставени по възраст и ИТМ. Клиничните характеристики на участниците в изследването са представени в допълнителна таблица 1. Кръвните проби са разделени в серумни и периферни кръвни мононуклеарни клетки.

Изолиране на обогатени с екзозоми извънклетъчни везикули и анализ на проследяването на наночастици

Извънклетъчните везикули са получени от серум с miRCURY Exosome Isolation Kit - Serum and Plasma (Exiqon, Vedbaek, Дания), съгласно инструкциите на производителя. Изолирани проби от извънклетъчни везикули се анализират, като се използва анализ на проследяване на наночастици (NTA). Пробите бяха заредени в камерата за проби на единица NS500 (NanoSight, Amesbury, Великобритания) и бяха записани пет 1-минутни видеоклипа от всяка проба (праг, 6 - мулти; размазване, автоматично; и минимален очакван размер на частиците, автоматично). Анализът на данните беше извършен със софтуера NTA 2.3 (NanoSight) и бяха изчислени размерът и концентрацията на частиците, включени в пробите на извънклетъчните везикули. Аликвотна част от изолирани екзозомни обогатени извънклетъчни везикули от серума се използва за NTA, а останалите изолирани извънклетъчни везикули се използват за екстракция на екзозомна РНК (екзоРНК).

Екстракция на РНК и оценка на експресията на miRNA

Първична човешка скелетна мускулна култура и протокол за трансфекция на miRNA

Сателитните клетки бяха изолирани от скелетните мускули на wideus lateralis, както беше описано по-рано (30). Клетъчните култури се поддържат при 37 ° C под 7,5% CO2 като миобластни клетки. За измерване на генната експресия, миобластните клетки са диференцирани в миотръби, както е описано по-рано (31). Клетки на миотръби, при които се наблюдава сливане и многоядрение на ден 10 след започване на диференциацията, бяха използвани за пълна екстракция на РНК, откриване на протеини и клетъчни анализи. Клетките се трансфектират, като се използва протокол за двойна трансфекция 48 часа след диференциацията (ден 6) и 48 часа по-късно (ден 8) с 10 nmol/L Ambion miRNA-20b-5p (Thermo Fisher Scientific). Контролните клетки бяха трансфектирани с разбъркан миРНК имитиращ (10 nmol/L). Всяка трансфекция се извършва в продължение на 5 часа с трансфекционни комплекси, образувани в редуцирана серумна среда (OptiMEM; Thermo Fisher Scientific), като се използва Lipofectamine RNAiMAX трансфекционен реагент съгласно протокола на производителя. РНК се изолира с помощта на miRNeasy Kit (QIAGEN) на ден 10.

Култура на човешки ембрионален бъбрек (HEK293) и човешки хепатоцелуларен карцином (HepG2) клетки и протокол за miRNA трансфекция

Клетките HEK293 и HepG2 бяха получени от ATCC и култивирани в DMEM с високо съдържание на глюкоза (4.5 g/L), допълнен с 10% (обем/обем) FBS. miRNA-20b-5p или miRNA имитиращ се трансфектира в тези клетки, използвайки Lipofectamine RNAiMAX трансфекционен реагент съгласно протокола на производителя, и РНК се изолира с помощта на miRNeasy Kit (QIAGEN).

Анализ на микрочипове

Съдържанието на мРНК от трансфектирани от miR-20b клетки се профилира чрез хибридизиране на биотинилирана сетивна верига cDNA към масиви GeneChip Human Gene 2.0 ST (Thermo Fisher Scientific). СДНК на сензорната верига е синтезирана от обща РНК и биотин, маркиран с GeneChip WT PLUS Reagent Kit (Thermo Fisher Scientific), преди да бъде хибридизирана с масиви. Генните масиви бяха измити, оцветени и сканирани според инструкциите на Affymetrix (Санта Клара, Калифорния). Предварителната обработка на данните беше извършена, като се използва стабилна средна стойност на множество масиви с нормализиране на квантила на скицата от софтуера Expression Console (Affymetrix). Диференциалната експресия на транскриптите беше определена чрез сдвоено сравнение на класа с едновариатен тест, използващ модел на произволна дисперсия, сравняващ генната експресия на контрола (миРНК имитирани-трансфектирани клетки) спрямо miR-20b-5p-трансфектирани клетки. Гени със скорост на фалшиво откриване −ΔΔCt .

Имуноблот анализ

Анализът на Western blot беше извършен, както е описано по-рано (32). Съдържанието на протеин в супернатантите се определя от BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Мембраните бяха оцветени с Ponceau S, за да се потвърди еднакво натоварване на пробите и контрол на качеството за процедурата по прехвърляне. Мембраните бяха инкубирани с първични антитела, насочени към гликоген синтаза (номер 3893; Cell Signaling Technology), фосфорилирана (фосфо) - гликоген синтаза (3891; Cell Signaling Technology), AKT (9272; Cell Signaling Technology), фосфо-AKT (Thr 308) (4056; Технология за клетъчна сигнализация), преобразувател на сигнал и активатор на транскрипция (STAT) 3 (9139; Технология за клетъчна сигнализация) и GAPDH (sc-25778; Санта Круз Биотехнология, Далас, Тексас). Мембраните бяха инкубирани с подходящо за вида конюгирано пероксидазно хряново вторично антитяло, преди протеините да бъдат визуализирани чрез засилена хемилуминесценция (Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK). Когато е уместно, съдържанието на протеин се определя количествено чрез денситометрия (Quantity One; Bio-Rad). Всички количествени оценки бяха извършени с помощта на положителен контрол за контрол на интергелната променливост.

Измерване на активността на луциферазата

Включване на глюкоза в гликоген

Инсулин-стимулираното включване на глюкоза в гликоген беше определено, както е описано по-рано (30).

Статистика

Количествено определяне на изолирани обогатени с екзозоми серумни фракции чрез NTA. Размер на диаметъра на частиците (A) и концентрацията на частиците (B) на екзозомите, определени от NTA. Стойностите представляват средна стойност ± SEM за n = 20 мъже с нормален глюкозен толеранс (NGT) и n = 21 мъже с диабет тип 2 (T2DM). Във всички графични полета централните линии показват медианите; границите на кутиите показват 25-ия и 75-ия персентил, определени от софтуера R; мустаците се разширяват 1,5 пъти в интерквартилния диапазон от 25-ти до 75-и персентил, а отклоненията са представени с точки. n = 20 и 21 пробни точки за контролни субекти и лица с диабет тип 2, съответно.

Диференциално експресирани miRNAs в ExoRNA и обща серумна РНК от мъже с нормална глюкозна толерантност или диабет тип 2

Известно е, че екзозомите носят некодиращи РНК (6), като miRNA. Определихме профила на експресия на miRNA на екзоРНК, получена от серум от мъже с нормален глюкозен толеранс или диабет тип 2. За първоначалния скрининг, exoRNA беше извлечена от четирима мъже с нормален глюкозен толеранс и четирима мъже с диабет тип 2 и експресията на miRNA беше профилирана с помощта на qPCR панел. Четирима мъже от всяка група бяха избрани на случаен принцип, все още съвпадащи по възраст и ИТМ. В този първи екран бяха идентифицирани шест екзозомни miRNAs (miR-20b-5p, miR-532-3p, miR-150-5p, miR-502-3p, miR-363-3p и miR-30d-3p) нагоре или надолу регулирани сред 179 miRNAs, включени в панела qPCR (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Диференциален експресионен анализ на изобилието на miRNA в exoRNA

Корелация на клиничните параметри със съдържанието на екзозомна miRNA

miRNAs са предложени като прогресивни биомаркери при различни заболявания (19,33). По този начин определихме дали експресията на екзозомни miRNAs корелира с клиничните параметри в кохортите на изследването (Таблица 2). Обогатеното с екзозома съдържание на извънклетъчни везикули на miR-150-5p не корелира с клиничните характеристики на кохортите на изследването (данните не са показани), докато съдържанието на miR-20b-5p корелира с 2-часовата глюкоза, както и с процента мазнини маса, при мъжете с нормален глюкозен толеранс (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Съотношение между екзозомно съдържание на miR-20b-5p и клинични характеристики

miR-20b-5p Намалява STAT3 в човешките клетки

От двете miRNAs, които бяха идентифицирани като по-силно експресирани в обогатени с екзозома на серума извънклетъчни везикули от мъже с диабет тип 2, miR-20b-5p показва по-голямата гъвкава промяна в данните на панела qPCR (Таблица 1) и miR-20b- Съдържание на 5р в обогатени с екзозома на серума извънклетъчни везикули от мъже с нормален глюкозен толеранс, корелиран с 2-часови стойности на глюкозата (Таблица 2). По този начин, miR-20b-5p беше трансфектиран в три различни типа човешки клетки, за да се оценят ефектите на miR-20b-5p върху генната експресия. miR-20b-5p беше свръхекспресиран в HEK293 (бъбречна клетъчна линия), HepG2 (чернодробна клетъчна линия) и първични човешки скелетни мускулни клетки. Експресията на miR-20b-5p се увеличи значително и при трите типа клетки (данните не са показани). STAT3 е директна цел на miR-20b-5p в MCF-7 ракови клетки на гърдата (34) (допълнителна фигура 2А); по този начин, ние определихме ефекта на експресията на miR-20b-5p върху mRNA и съдържанието на протеин в STAT3 в трансфектираните клетки. Докато STAT3 mRNA беше намалена чрез miR-20b-5p трансфекция както в HepG2, така и в човешки скелетни мускулни клетки, STAT3 mRNA в HEK293 не беше засегната (Фиг. 2А). Освен това, STAT3 протеинът е редуциран чрез miR-20b-5p трансфекция само в човешки скелетни мускулни клетки (фиг. 2В).

Ефекти от свръхекспресията на miR-20b-5p върху STAT3 иРНК и изобилието на протеини в човешките клетки. Стълбовата графика показва генна или протеинова експресия по отношение на трансфектираната с отрицателен контрол (NC) клетъчна базална. Експресия на ген на stat3 (A) и протеинова експресия на STAT3 (B) в miR-20b-5p (miR-20b) -експресирани клетки, получени от различни човешки тъкани. * P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Резюме на GSEA

След това се съсредоточихме върху валидирането на гените, които бяха регулирани надолу след трансфекция на miR-20b-5p. Идентифицирахме шест гена (промяна в експресията> 2.5, P стойности> 0.005) като възможни директни миР-20b-5p целеви кандидати въз основа на идентификация на целево сканиране на предполагаемите целеви места на miR-20b-5p (Таблица 4) Тези шест гена бяха цитохром b редуктаза 1 (CYBRD1), член на семейството на TBC1 домейн 2 (TBC1D2), AKT (известен също като PKB) взаимодействащ протеин (AKTIP), инхибитор на RNase/ангиогенин 1 (RNH1), интегрална мембрана на гликопротеин 1 (GINM1) и мускулен кофилин 2 (CFL2). За потвърждаване на данните за микрочиповете на тези шест гена е извършен индивидуален qRT-PCR анализ и е потвърдена намалена експресия на всички цели, с изключение на RNH1 (Таблица 4).

индуцирани от miR-20b-5p надолу регулирани гени в скелетните мускулни клетки на човека

Изобилие от протеини и сигнализиране за инсулин в скелетните мускулни клетки, изразяващи miR-20b-5p