Допринесе еднакво за тази работа с: Валери Исидоров, Лукаш Шока, Йоланта Назарук

екстракти

Роли Концептуализация, разследване, надзор, писане - оригинален проект

Присъединителен горски факултет, Технически университет в Белосток, Hajnówka, Полша

Допринесе еднакво за тази работа с: Валери Исидоров, Лукаш Шока, Йоланта Назарук

Разследване на ролите, методология

Отделение за медицинска химия, Медицински университет в Белосток, Белосток, Полша

Допринесе еднакво за тази работа с: Валери Исидоров, Лукаш Шока, Йоланта Назарук

Методология на ролите, писане - оригинален проект

Катедра по фармакогнозия, Медицински университет в Белосток, Белосток, Полша

  • Валери Исидоров,
  • Лукаш Шока,
  • Джоланта Назарук

Фигури

Резюме

Цитат: Isidorov V, Szoka Ł, Nazaruk J (2018) Цитотоксичност на екстракти от бяла брезова пъпка: Перспективи за терапия на тумори. PLoS ONE 13 (8): e0201949. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201949

Редактор: Дейвид А. Лайтфут, Колеж по селскостопански науки, САЩ

Получено: 1 март 2018 г .; Прието: 25 юли 2018 г .; Публикувано: 14 август 2018 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена с безвъзмездна помощ от Националния научен център (Полша) 2016/23/B/NZ7/03360 на V.I., както и от Програмата за технологичен университет в Белисток S/ZWL/1/2017 на V.I. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Брезата (Betula L.) е едно от основните дървесни растения в горите на бореални и умерени зони, както и в планинските райони на Северното полукълбо [1]. Това е лечебно растение, което се използва в традиционната медицина от древни времена. Традиционното му използване е добре документирано в етноботаническата литература [2–11]. Листата, пъпките, катранът и етеричните масла се използват за лечение на широк спектър от заболявания, включително възпаление, инфекции, нарушения на пикочните пътища, проблеми с кожата и косата [12–14]. В полската народна медицина се използва етанолна мацерация на пресни пъпки от B. pendula при кървящи рани [15]. Пъпките, събрани през зимата, бяха взети вместо листа като диуретично средство [5]. В руската народна медицина етанолните мацерации се използват вътрешно за лечение на стомашни разстройства и треска и външно за лечение на ревматизъм [16].

В съвременна Русия (както и в бившия СССР), сбор от брезови пъпки, Gemmae Betulae, е стандартизиран медицински препарат [17]. Научно доказаните ползи за здравето на екстрактите от пъпки се дължат преди всичко на диуретичния им ефект [9,11] и антимикробните и антиоксидантни свойства [10,18–20]. Само анекдотични публикации са посветени на противораковата активност на брезовите пъпки [21–23]. Въпреки широкото използване на брезови пъпки в народната медицина и нарастващия интерес на конвенционалната медицина към този билков материал, настоящата информация за химичния му състав е недостатъчна за медицински цели.

Една от основните цели на това изследване беше да се запълни тази празнина чрез определяне на химичния състав на брезовите пъпки. Препаратът Gemmae Betulae е описан като смес от Betula pendula Roth. и Betula pubescens Ehrh. (Betulaceae) пъпки, но пропорциите не са регулирани. Въпреки това наскоро бяха демонстрирани съществени разлики в химичния състав на смолите, покриващи пъпките на тези тясно свързани видове [24]. Освен това е добре известно, че химичният състав на всеки растителен препарат (и вследствие на това неговата биологична активност), в много отношения зависи от процедурата, използвана за екстракция. Поради тази причина използвахме три различни процедури за екстракция на пъпки от всеки от видовете бяла бреза.

Втората основна цел беше да се оцени противораковия потенциал на тези екстракти, за да се изследва връзката между състава и противотуморната активност и да се идентифицират екстракти, достойни за по-нататъшно разследване.

Материали и методи

Реактиви и химикали

Модифицираната среда на Dulbecco Eagle's (DMEM), минималната съществена среда (MEM), Мемориалният институт на Розуел Парк 1640 Medium (RPMI 1640), фетален говежди серум (FBS), буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS), натриев пируват, трипсин, пеницилин и стрептомицин бяха получено от Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). [3Н] тимидин е закупен от Hartmann Analytic (Брауншвайг, Германия). Натриевият додецил сулфат (SDS) е получен от Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Диметил сулфоксид (DMSO), 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT), глицин, натриев хлорид, натриев хидроксид и цисплатин са закупени от Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, САЩ).

Растителен материал

Пъпки от пухеста бреза (Betula pubescens Ehrh.) И сребърна бреза (Betula pendula Roth.) Са събрани през август – септември 2015 г. от дървета, растящи в националния парк Biebrza в североизточна Полша (53 ° 32 'N, 22 ° 43' E) . Образци на ваучери (без BP-17034 и BO-17035) са депозирани в хербариума на Катедрата по фармакогнозия, Медицински университет в Белосток (Полша). По-рано описан метод беше използван за идентифициране на видовете бреза [25]. Растителният материал се поддържа при -18 ° C преди употреба.

Приготвяне на проби и химичен анализ

Екстракция на свръхкритична течност с въглероден диоксид (SFE) от пъпки е извършена през октомври 2015 г. в лабораторията за техника под високо налягане към Отдела за свръхкритична екстракция в Института за нови химически синтези (Puławy, Полша). Експерименталните параметри бяха, както следва: екстракционно налягане 300 bar, температура 40 ° C; добивът на продукта е около 7,2%. Екстрактите бяха светложълти и леко вискозни с характерния брезов аромат.

Ексудатите, покриващи пъпките от всеки от брезовите видове, се екстрахират чрез интензивно изплакване на пробите от пъпки (15–20 g) в продължение на 60 s в диетилов етер (50 ml). Екстрактите се филтрират през хартиения филтър и разтворителят се изпарява до сухо.

Измитите пъпки се смилат и незабавно се прехвърлят в реторта от 250 ml обем и се екстрахират при постоянно разбъркване, като се използват три обема 50 ml диетилов етер. Продължителността на всеки цикъл на екстракция при стайна температура е 30 минути. Комбинираните екстракти от диетилов етер се филтрират през хартиен филтър и разтворителят се отстранява на роторен изпарител.

Около 5 mg от остатъка от ексудат и екстракт, оставени по стените (както и 5 mg SFE продукти), се поставят във флакон с обем 2 ml. След разтваряне в 220 μL пиридин, 80 μL BSTFA се добавят към флакона. Реакционната смес се запечатва и се нагрява в продължение на 0,5 часа при 60 ° С, за да се получат производни на триметилсилил (TMS). Цялата процедура се извършва в три екземпляра.

Получените разтвори се разделят и анализират чрез GC-MS на газов хроматограф HP 7890A с тройноосен детектор 5975C VL MSD (Agilent Technologies, САЩ). Апаратът е снабден с капилярна колона HP-5MS (30 m × 0,25 mm, дебелина на фолиото 0,25 μm), с електронно управление на налягането и разделен/без разделен инжектор. Последният работеше при 250 ° C в режим разделяне (1:50). Скоростта на потока на хелий през колоната е 1 mL/min в режим на постоянен поток. Инжектирането на 1 μL от пробата се извършва с помощта на автосамплер G4513a. Инжекторът (250 o C) работи в разделен режим (1:50). Първоначалната температура на колоната беше 50 o C, покачвайки се до 310 o C при 5 o C/min. Параметрите на MSD за получаване на детектора бяха както следва: температурата на трансферната линия беше 280 o C, температурата на MS източника 230 o C и квадратурата на MS 150 o C. Електронните масови спектри бяха получени при 70 eV йонизационна енергия. Откриването се извършва в режим на пълно сканиране от 41 до 650 сутринта. След интегрирането се изчислява фракцията на отделените компоненти в общия йонен ток (TIC).

За да се идентифицират компонентите, бяха използвани както мас-спектрални данни, така и изчислените индекси на задържане. Масспектрометричната идентификация беше извършена с автоматична система за обработка на данни GC-MS, предоставена от NIST и домашно направени библиотеки за масови спектри. Последният съдържа повече от 1800 спектъра на TMS производни, приготвени от автентични препарати от флавоноиди и други фенолни съединения, както и терпеноиди, алифатни киселини, алкохоли и въглехидрати.

Хексановият разтвор на С10-С40 н-алкани се отделя при горните условия. Програмираните индекси на задържане с линейна температура (IT) на регистрираните компоненти са изчислени от резултатите от разделянето на този разтвор и силанизирани екстракти от пъпки и са сравнени с колекцията NIST [26], както и с публикуваните преди това данни на авторите [24, 27–29]. Идентификацията се счита за надеждна, ако резултатите от компютъризираното търсене на библиотеката на масспектрите са потвърдени от експерименталните стойности на I T, т.е. ако отклонението им от осреднените публикувани стойности не надвишава ± 10 u.i. (за повече информация вижте Допълнителна информация, S1 текст).

Клетъчна култура

Човешки аденокарцином на гърдата MCF-7 и MDA-MB-231 клетки, човешки колоректален аденокарцином DLD-1 клетъчна линия, човешки меланом C32 клетки, човешки стомашен аденокарцином AGS клетки, човешки глиобластом клетъчни линии LN-18 и LN-229 и фибробласти на човешката кожа CCD -25Sk са получени от ATCC (Manassas, VA, USA). Клетъчната линия на човешкия ендометриален аденокарцином (Ishikawa), човешкият аденокарцином на шийката на матката HeLa и човешкият хепатоцелуларен карцином HepG2 клетки са закупени от Sigma-Aldrich. Клетките се култивират в DMEM (с изключение на DLD-1 клетките за RPMI 1640 и за HeLa и HepG2 клетките за MEM), допълнени с 10% FBS, 100 единици/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин в овлажнен 5% CO2 атмосфера при 37 ° C.

Анализ на цитотоксичността

Жизнеспособността на клетките се определя чрез MTT анализ [30]. Клетките се отделят с 0,25% трипсин и се засяват при 1 х 104 клетки на гнездо в 96-гнездни плаки. След достигане на сливане, тестваните екстракти и противоракови лекарства, използвани като положителни контроли, бяха добавени. Екстрактите се разтварят в DMSO, разреждат се с прясна среда и се поставят в 96-ямкови плаки при обем от 200 μL на гнездо. Крайната концентрация на DMSO не надвишава 0,1%. Контролните клетки се култивират в среда, съдържаща 0,1% DMSO. Цисплатинът се разтваря в среда. След 48 h, 100 μL от 0,4% MTT разтвор в PBS се добавят към всяка ямка за 4 h. Средата се отстранява и кристалите на формазан се разтварят в 200 μL DMSO и 25 μL глицинов буфер на Sorensen за 10 минути на шейкър за плочи. Оптичната плътност се измерва в четец за микроплаки (Biochrom, Cambourne, United Kingdom) при 570 nm.

[3Н] анализ за включване на тимидин

[3Н] включването на тимидин се използва като измерване на клетъчната пролиферация. Клетките се засяват при 1 х 104 клетки на гнездо в 24-гнездови плаки за тъканна култура с 1 ml среда за растеж. След 24 часа клетките се инкубират с различни концентрации на екстракти или цисплатин и 0,5 μCi [3Н] тимидин в продължение на 24 часа. След това средата се отстранява и клетките се промиват три пъти с ледено студен PBS и се лизират в 1 ml 0,1 М натриев хидроксид, съдържащ 1% SDS. Клетъчните лизати се прехвърлят в сцинтилационни флакони и се добавят 3 ml от сцинтилационната течност (Perkin Elmer, Waltham, USA). Количеството [3 H] тимидин, включено в ДНК, се определя в сцинтилационен брояч (Perkin Elmer).

Статистически анализ

Резултатите са представени като средно ± SEM на поне два независими експеримента. Разликите между средствата за третирани с екстракти групи и третирани с носител групи бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от теста на Tukey. Стойностите на P T, m/z на целевите йони и молекулните йони, M +) са представени като допълнителна информация (S1 Фиг., S1 Таблица).

Както се вижда от данните в таблица 1, сесквитерпеноидите са основната група съединения в пухкавата бреза, докато в сребърните брезови пъпки преобладават тритерпеноидите. Втората основна група, открита в екстрактите от пухеста бреза, са флавоноидите (24,57% от TIC), но те са открити при значително по-ниски нива в пъпките от сребърна бреза (1,3‒4,9% от TIC). Флавоноидите в брезовите пъпки вероятно са били метоксилирани флавони и 3-хидроксифлавони. Катехинът, флаван-3-ол, е открит в забележими количества само в сребърни брезови пъпки. Някои от тези съединения по-рано са били идентифицирани в сребърни брезови пъпки [31], но доколкото ни е известно, куматакенин, 3'-метоксиапигенин и цирсимаритин не са били открити преди това в брезовите пъпки.

Наблюдавани са и специфични за вида разлики в състава на фенилпропаноидите. Естери на сесквитерпенови алкохоли и хидроксикинамиеви киселини са открити само в пухкави брезови пъпки, въпреки че п-докозил р-кумарат е характерен и за двата вида.

Цитотоксична и антипролиферативна активност на екстракти от пъпки

Цитотоксичността на екстракти от пъпки на B. pendula и B. pubescens върху ракови клетки и нормални фибробласти е оценена чрез MTT анализ. Често използваното противораково лекарство цисплатин се използва като референтно средство. Клетките се третират с екстракти за 24, 48 и 72 часа. Концентрациите на екстракти, предизвикващи 50% намаляване на жизнеспособността на клетките (IC50) са показани в Таблица 2. Стойностите на IC50 са определени от кривите концентрация-отговор, представени в Допълнителна информация (S2 Фиг.). Всички изследвани екстракти индуцират висока концентрация и зависимо от времето намаление на жизнеспособността на клетките. Като цяло, етерните екстракти от двата вида бреза проявяват по-ниско инхибиране на клетъчната жизнеспособност от SFE или ексудатите. Най-чувствителните клетъчни линии в сравнение с фибробластите са LN-18, MDA-MB-231 и HeLa. Цитотоксичният ефект на цисплатина също зависи от концентрацията и времето, но е по-силен от всички екстракти от пъпки на Betula. Въпреки това, IC50 за намаляване на жизнеспособността на клетките обикновено е по-нисък при фибробластите, отколкото при раковите клетки.

Дискусия

В това проучване демонстрирахме мощната цитотоксична и диференциална активност на екстракти от пъпки на B. pendula и B. pubescens. Групата от съединения, които биха могли значително да повлияят на противораковата активност, бяха тритерпените, които бяха доминиращи във всички екстракти от B. pendula. Много изследвания потвърждават, че тази група естествени компоненти има различни потенциални начини на противораково действие [32]. По-рано е демонстрирано, че тритерпените от тип дамаран от Betula spp. притежават цитотоксична активност към асцитните клетки на карцинома на Ерлих. Действието на тези съединения е свързано с ефект върху микровискозитета на мембраните на туморните клетки [33]. Друга важна група съединения с противоракова активност са флавоноидите, особено метоксилираните производни на флавоните. По-рано беше показано, че О-метилирането повишава цитотоксичността върху човешките левкемични клетки [34]. Такива съединения са открити в повечето екстракти от двата вида бреза, но са били на по-високи нива в B. pubescens. Сесквитерпеноидите могат също да допринесат за цитотоксичната активност на екстрактите от брезови пъпки, ако не директно, поне косвено. Например Legault и Pichette [35] демонстрират, че β-кариофилен повишава противораковата активност на други вещества.

Според литературата естерите на канелените киселини с алифатни алкохоли показват различна биологична активност [36,37]. Например, фенилпропеноидите на два терпенови алкохола (гераниол и фарнезол) имат инхибиторен ефект върху производството на азотен оксид и проявяват противотуморна активност [38]. Експериментите in vitro показват, че синтетичните естери на ферулова и кофеинова киселини имат способността да инхибират развитието на рак на дебелото черво, стомаха и клетките на гърдата [37].

Сред изследваните ракови клетъчни линии LN-18, MDA-MB-231 и HeLa са по-чувствителни към цитотоксичното действие на тестваните екстракти от фибробластите. Това показва, че подобно на противораковото лекарство, използвано като еталон, екстрактите от пъпките на Betula не показват обща селективност към раковите клетки. Независимо от това са необходими допълнителни проучвания за изолиране и идентифициране на чисти съединения с противоракова активност.

Подкрепяща информация

S1 Текст. Аналитична процедура.

S1 Таблица. Химичен състав на екстракти от брезови пъпки.

S1Table представя химическия състав на екстрактите (SFE, ексудат и етерен екстракт от смлени пъпки) и някои от аналитичните параметри: I T стойности, m/z целеви пикове и молекулен йон, M + (ако е регистриран).