Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

фосфолипаза

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Пълна кореспонденция: Професор Рейчъл Леви, Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер Шева 84105, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер-Шева, Израел

Пълна кореспонденция: Професор Рейчъл Леви, Лаборатория по имунология и инфекциозни болести, Катедра по клинична биохимия и фармакология, Факултет по здравни науки, Университет Бен-Гурион в Негев, Медицински университетски център Сорока, Беер Шева 84105, Израел

Резюме

Въведение

Възпалителните заболявания на червата (IBD) включват група хронични, рецидивиращи нарушения на тънките черва и дебелото черво, най-честите от които са улцерозен колит (UC) и болест на Crohn (CD). В дебелото черво както UC, така и CD генерират множество симптоми, които включват хронично възпаление, диария, ректално кървене, коремна болка и загуба на тегло. Въпреки че точните молекулярни и клетъчни събития зад IBD не са напълно обяснени, IBD се определя най-добре като сложно заболяване, провокирано както от генетични, така и от компоненти на околната среда. Най-очевидните характеристики на IBD са хроничното възпаление, обхващащо различни региони на чревния тракт и повишен риск от рак, усложнение, пряко свързано с продължителността и степента на възпалителния процес 1, 2. Имунната патогенеза на IBD е свързана с увеличаване на възпалителните медиатори, включително азотен оксид (NO) 3, 4, простагландини 5 и провоспалителни цитокини като туморна некроза алфа (TNF-α), интерлевкин (IL) 6 и IL‐ 23 6, 7 .

Резултати

регулиране и активиране на cPLA2α в развитието на колит в DSS-индуциран колит миши модел

За да се определи ролята на cPLA2α в развитието на колит, неговата експресия беше определена в миши модел на колит по време на 7-дневно лечение на DSS, едновременно с развитието на заболяването, определено от дължината на дебелото черво, телесното тегло и Индекс на активността на заболяването (DAI). Фигура 1А изобразява представителни дебелото черво (пет мишки/група), изследвани на всеки ден от DSS лечение. Средните стойности ± SEM от дължината на дебелото черво на всяка група са представени на фигура 1В. Значителен (стр

Миелопероксидазата (MPO) е ензим, произведен главно от полиморфноядрени левкоцити и надежден маркер за степента на тяхното проникване в тъканите. Установено е, че набирането на неутрофили в дебелото черво на третирани с DSS мишки, открито чрез MPO в лизати на дебелото черво, е значително по-високо от ден 4 на заболяването (стр

Роля на регулирането на cPLA2α в развитието на колит в DSS-индуциран колит миши модел

За да се определи ролята на регулирането на cPLA2α в развитието на колит в миши модел на DSS-индуциран колит, регулирането на cPLA2α е предотвратено чрез прилагане in vivo на антисенс нуклеотид срещу cPLA2α (AS). Два милиграма на килограм AS или съответното усещане (SE) се прилага интравенозно 1 ден преди и всеки ден през 7-те дни на излагане на DSS в питейна вода. Имуноблот анализът на лизати на дебелото черво (фиг. 3А) и имунофлуоресцентният анализ на участъци от тъкани на дебелото черво (фиг. 3В) показват, че лечението с AS, но не и приложението на SE предотвратява свръхекспресията на cPLA2α. Активността на cPLA2α, измерена чрез фосфорилиране върху серин 505, също се инхибира в лизати на дебелото черво на третирани с AS мишки, изложени на DSS (Фиг. 3А). Както е показано на представителните снимки на дебелото черво (фиг. 3С) и на дължината на дебелото черво при всяка мишка в различните групи (фиг. 3D), дължината на дебелото черво при третирани с AS мишки е значително увеличена в сравнение с тази на контролната SE Третирани мишки, без припокриване между групите (стр

Проведено е хистологично изследване на участъците на дебелото черво, за да се прецени чревния възпалителен статус (Фиг. 3F). Микроскопски, пробите от дебелото черво, събрани от индуцирани от DSS мишки с колит, показват типично увреждане на лигавицата и възпалителни промени в архитектурата на дебелото черво, като улцерация, разширяване на криптите и изчерпване на бокаловите клетки, както и инфилтрация на възпалителни клетки. За разлика от тях, хистологичният анализ на дебелото черво от лекувани с AS мишки показва значително по-малък брой инфилтриращи клетки и по-малка степен на увреждане и оток на лигавицата.

При тези условия AS лечението, но не SE лечението, значително предотврати набирането на неутрофили, оценено чрез MPO, ICAM-1 повишаване на регулацията (фиг. 4A), секреция на LTB4 (фиг. 4C), iNOS и регулиране на COX-2 (фиг. 4D), Секреция на TNF-α (фиг. 4Е) и активиране на NF-кВ (фиг. 4F). Предотвратяването на инфилтрация на неутрофили чрез лечение с AS също е доказано чрез оцветяване с NIMP-R14 (Фигура 4В). Дължината на дебелото черво, DAI резултат и микроскопичните характеристики не се променят при лечение с AS на контролни здрави мишки (данните не са показани).

Дискусия

За разлика от нашите резултати, скорошно проучване 26 съобщава за повишена тежест на колит при cPLA2α-нокаутиращи мишки, изложени на DSS. Авторите предполагат, че влошаването на заболяването се дължи на повишена мукозна язва, свързана с намалени нива на няколко ейкозаноидни метаболита, включително PGE2, който е от решаващо значение за целостта на лигавицата и заздравяването на раните на стомашно-чревния тракт 27. Въпреки това, при cPLA2α-нокаутиращи мишки скоростта на възстановяване е подобна на тази при третирани с DSS мишки. За разлика от мишките, при човешки пациенти с дефицит на cPLA2α се съобщава, че имат нормално дебело черво въпреки кървенето в тънките черва 28-30. Предимството на техниката AS пред нокаутиращите мишки е способността да се предотврати индуцирането на ускорен протеин на мястото на възпалението и да се даде възможност за неговата експресия на базални нива. Докато при нокаутиращите модели на мишки, пълното елиминиране на протеин може да доведе до драстични промени в хомеостазата и/или компенсация чрез повишено регулиране на други протеини (със сходни биологични характеристики).

В заключение, в настоящото проучване ние показваме, използвайки DSS-миши модел на колит, че инхибирането на регулирането на cPLA2α в дебелото черво на мишката е предотвратило активирането на транскрипционния фактор NF ‐ κB и производството на няколко възпалителни медиатори, включително инфилтрация на неутрофили, образуване на ейкозаноиди и цитокини, както и регулиране на iNOS и COX ‐ 2, за които е доказано, че участват в развитието на възпаление на колит. Ние вярваме, че механистичното участие на свръхекспресията на cPLA2α в регулирането на широк спектър от провъзпалителни медиатори на колит затвърждава мнението, че cPLA2α играе решаваща роля в развитието на заболяването.

Материали и методи

Модел на колитска мишка

Изследването е одобрено от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета Бен-Гурион (IL ‑ 40‐05‐2012) и е проведено съгласно израелския Закон за хуманно отношение към животните, следвайки насоките на Ръководството за грижа и използване на лабораторните животни Съвет, 1996 г.). Четириседмични мъжки мишки C57BL/6J са закупени от лаборатории Jackson (Jackson, Bar-Harbor, ME, USA). След 1 седмица адаптация, колитът се индуцира чрез прилагане на 2,5% DSS (6 16. DSS разтворът се подменя ежедневно. Мишките се изследват ежедневно за симптоми на колит чрез проследяване на телесното тегло, ректалното кървене и консистенцията на изпражненията. Цялостната тежест на заболяването се оценява чрез система за клинично оценяване със скала 0–4 за всеки параметър 48. На 7-ми ден мишките са евтаназирани от Изофлуран (Minrad, Buffalo, NY, USA).

Хистологична оценка

Цели дебелото черво бяха отстранени, обилно измити, фиксирани за 24 часа в 10% буфериран формалин и обработени за вграждане на парафин. Депарафинизираните срезове на дебелото черво се промиват в PBS 1% Triton X-100 в продължение на 30 минути. Тканевите срезове се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) или чрез имунофлуоресценция. Неспецифичната реактивност се инхибира чрез инкубация в продължение на 60 минути в блокиращ разтвор на 10% нормален магарешки серум. След това тъканните секции бяха инкубирани с разреждане 1: 100 на заешко поликлонално антитяло срещу cPLA2α от мишка (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) в блокиращ разтвор за една нощ. След три измивания в PBS, секциите бяха инкубирани в продължение на 2 часа с вторичното антитяло Cy-3 анти-заек 1: 200 (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA).

Неутрофилно оцветяване от моноклонално анти-NIMP-R14 антитяло срещу плъх за идентифициране на неутрофили (Novus Biological) беше анализирано, както е направено преди 15. Неспецифичната реактивност беше блокирана чрез инкубиране на стъклата с 20% нормален заешки серум в продължение на 20 минути с авидин-биотин VECTA-STAIN Kit Elite PK 6105 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). След това секциите бяха инкубирани в 1:10 разреждане на анти-NIMP-R14 антитела в PBS за 1 h при стайна температура, измити и допълнително инкубирани с 1: 200 разреждане на биотинилиран анти-плъхов IgG, последван от авидин-биотин комплекс/HRP ‐DAB, което доведе до кафяво оцветяване на неутрофили. Срезите бяха оцветени с хематоксилин.

За всяко лечение се приготвя отрицателна контрола без първичното антитяло. Всички оцветявания бяха анализирани сляпо с помощта на микроскоп Olympus BX ‐ 60.

Антисенс олигонуклеотиди

Олигонуклеотидите срещу cPLA2α (съвпадащи както с човек, така и с мишка) са конструирани с помощта на компютърно базиран подход RNADraw V1.1 (Mazura Multimedia, Швеция). Използван е антисмислен олигонуклеотид (tcaaaggtctcattccacaand) и съответния му смисъл с фосфоротиоатни модификации на последните три основи в двата 5 ′ и 3 ′ края.

Western blot анализ

ELISA анализи

Нивата на LTB4 и TNF-α бяха измерени в тъканни лизати, използвайки търговски ELISA комплекти: TNF-α (Biolegend) и LTB4 (R&D системи, Минеаполис, MN, САЩ).

Статистически анализ

Данните са представени като средната стойност ± SEM. Значителни разлики от контролните условия бяха определени с помощта на едно- или двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от последващ тест на Bonferroni за множество сравнения, предоставен от GraphPad Prism версия 5.03 за Windows (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Конфликт на интереси

Авторите не декларират търговски или финансов конфликт на интереси.