Сабудж Бхатачария

1 Център за екологични науки, Индийски научен институт, Бангалор, Индия,

2 Катедра по животновъдни и растителни науки, Западна банка, Университет в Шефилд, Шефилд, Великобритания,

Дебора А. Доусън

2 Катедра по животновъдни и растителни науки, Western Bank, University of Sheffield, Sheffield, UK,

Хелън Хипърсън

2 Катедра по животновъдни и растителни науки, Western Bank, University of Sheffield, Sheffield, UK,

Фара Ищак

1 Център за екологични науки, Индийски научен институт, Бангалор, Индия,

Свързани данни

GPS местоположенията на всички пунктове за събиране на проби, R код и данни за генерализирано линейно моделиране, ДНК последователности, генерирани по време на изследването, могат да бъдат достъпни в базата данни Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.nt40m53).

Резюме

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Взаимодействията между растения и тревопасни животни осигуряват критична представа за различни екологични процеси, оформящи динамиката на общността в редица полета, свързващи ко-еволюцията (Ehrlich & Raven, 1964; Johnson, Campbell, & Barrett, 2015), химическата екология (Hay & Fenical, 1988; Rasher и др., 2015), фуражна и хранителна екология (Raubenheimer, Simpson, & Mayntz, 2009; Wetzel, Kharouba, Robinson, Holyoak и Karban, 2016). Тези взаимодействия са ключови детерминанти на механизмите, които управляват пространственото разпределение на вида, изобилието, динамиката на общността, първичната производителност и функция в хранителната мрежа (Lurgi, López и Montoya, 2012; Oerke, 2006) и въздействието на променящия се климат върху модели на ниво ландшафт в земна екосистема (Mulder, Koricheva, Huss-Danell, Hogberg и Joshi, 1999). Определянето на диетата на тревопасното животно е от основно значение за разбирането на трофичните взаимодействия и оценката на диетичната пластичност спрямо изменението на климата, както и за разработването на ефективни стратегии за мониторинг, управление и опазване (Bernstein et al., 2007).

В алпийските екосистеми пиките (Ochotona spp.), Дребни лагоморфи, са добри примери за това как променящият се климат влияе върху взаимодействието между растения и тревопасни животни. Американската пика (Ochotona princeps) е универсално тревопасно животно, чиято диета разчита много на алпийски растения (Ray, Beever и Loarie, 2012). Индуцирани от климата промени в разпространението и състава на растителността (Erb, Ray, & Guralnick, 2011; Jeffress, Rodhouse, Ray, Wolff, & Epps, 2013; Rodhouse et al., 2010; Wilkening, Ray, Beever, & Brussard, 2011) доведе до историческо изчезване на местните популации и скорошно свиване на ареала (Beever, Brussard, & Berger, 2003; Beever, Ray, Mote, & Wilkening, 2010; Stewart, Wright, & Heckman, 2017). По време на късния миоцен намаляването на наличността на предпочитани диетични растения С3 е свързано с изчезването на много родове пика в различни части на Африка, Евразия и Северна Америка (Ge et al., 2012, 2013).

Сезонната разлика в диетата (предсезонна спрямо постмозонна) ще покаже диетична гъвкавост, а пикасите ще избират растения с възможно най-голям хранителен прираст от наличните местообитания за хранене.

По-големите площи на местообитанието на талус ще доведат до повече наличност на растенията и ще увеличат видовото богатство на диетата.

Характеристиките на Talus като скална покривка и дълбочина на пукнатините биха увеличили видовото богатство в диетата, като осигуриха убежище от хищници и позволиха на пиките да имат достъп до по-голямо хранилище.

Гъбите и тревите съставляват най-голямата част от диетата им.

Пикас предпочита диети, богати на растения С3, което означава потенциална заплаха поради климатичните промени, тъй като растенията С3 зависят от високите валежи и ниската температура.

2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1. Проучвана зона, събиране на фекални пелети и данни за местообитанията

Пиката на Ройл обитава скални пукнатини в полета на талус с обхват от около 50 m 2 (Bhattacharyya et al., 2015; Kawamichi, 1968). През 2014–2015 г. бяха изследвани 104 местообитания на скални талуси и фекални пелети, събрани от пет обекта на височини между 2600 и 4450 м надморска височина (надм.): Chopta-Tungnath (TUN), Rudranath (RUD), Madmaheshwar (MAD: Kedarnath Светилище за диви животни), Хар ки Дун (HAR: Светилище за дива природа Govind) и Bedni ‐ Roopkund (NAN: Биосферен резерват Nandadevi; Фигура 1) в Гарвал, Утаракханд, Индия. Вземането на проби беше проведено в два сезона: postmonsoon (октомври до ноември 2014 г.) в TUN, RUD и HAK и premonsoon (май до юни 2015 г.) в TUN, MAD и NAN.

растения

Места за вземане на проби от фекални пелети в района Garhwal на Утаракханд, Индия [Цветна фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

След Bhattacharyya et al. (2015), ние избрахме 50 m 2 парцели за проучване във всяко местообитание на талус и те бяха търсени за свежи купчини фекални пелети (влажни, тъмнокафяви/черни). Едно място (HAK) имаше само стари (> 2 месеца) фекални купчини (светлокафяви и сухи). Фекалните гранули (TUN premonsoon = 42, postmonsoon = 40; NAN = 43; MAD = 19; HAK = 20; RUD = 8) бяха събрани в херметически затворени пластмасови туби от 2 ml, съдържащи силикагел (Merck, Индия) и бяха обозначени с дата, място за вземане на проби и географски координати (географска ширина и дължина). В допълнение, общата площ на талуса (в m 2) около всеки участък от проучването, разстоянието от най-близкия талус (интерталусно разстояние, в m), дълбочината на най-дълбоките цепнатини в талуса (1,5 m) и топографски характеристики като кота, наклон и аспект са записани. За всеки парцел от 50 m 2 визуално оценихме пропорцията на скална покривка, гъби (например Geum elatum и Potentilla atrosanguinea), треви (напр. Danthonia sp. И Poa sp.), Храсти (напр. Rhododendron campanulatum и/или Vivernum sp.) и дървета (напр. Abies pindrow, A. spectabilis, Quercus semecarpifolia и Rhododendron arboretum; Van Hees & Mead, 2000; Bhattacharyya et al., 2015).

2.2. ДНК метабаркодиране на фекални пелети

Диетата на Royle's pika е богата на вторични метаболити (Bhattacharyya et al., 2013), които често инхибират низходящите ензимни реакции при полимеразна верижна реакция (PCR; Weishing, Nybom, Wolff, & Meyer, 1995). Следователно, хомогенизирахме 20–30 mg от фекалните проби и екстрахирахме ДНК, използвайки QiAamp DNA Stool Kit (Qiagen, Манчестър, Великобритания), след незначителни модификации в протокола на производителя (напр. Инкубация през нощта при 56 ° C с буфер за лизис на ASL на изпражненията; Qiagen Inc., Германия). Тъй като пиката на Ройл е единственият вид лагоморф, присъстващ в района на изследване (Bhattacharyya, 2013; Green, 1985) с много различни фекални пелети, шансовете за погрешно идентифициране на фекалните проби бяха изключени.

2.3. Идентифициране на растителната диета от данни за секвениране

Биоинформативните анализи бяха извършени с помощта на Iceberg, високопроизводителния изчислителен клъстер в Университета в Шефилд, Великобритания. Четенията на сдвоените краища бяха филтрирани за качество (минимален качествен резултат 20 за плъзгащ се прозорец с 4 bp) и всички последователности на адаптера на Illumina бяха премахнати с помощта на Trimmomatic v 0.32 (Bolger, Lohse и Usadel, 2014), запазвайки само четения от поне 90 bp по дължина. За ITS2 филтрираните последователности след това бяха подравнени с помощта на FLASH (Magoč & Salzberg, 2011), изравнени последователности със съвпадения само с ITS2 последователностите на праймера бяха извлечени и праймерните последователности бяха премахнати с помощта на командата „trim_seqs“ в Mothur (Schloss et al., 2009). Областта ITS2 беше извлечена от цялата ампликонна последователност (която включва

73 bp от 5.8S rDNA последователност, Moorhouse-Gann et al., 2018) с помощта на ITSx (Bengtsson-Palme et al., 2013). Командите “derep_fulllength” и “uchime2_denovo” бяха използвани в софтуера usearch v 9.2.64 (Edgar, 2010) за елиминиране на всички последователности, които имаха по-малко от 10 копия на проба и всякакви химерни последователности. След това всяка уникална последователност ITS2, намерена в набора от данни, се сравнява с базата данни на NCBI GenBank нуклеотиди, използвайки алгоритъма BLAST (Altschul et al., 1997), за да се присвои таксономична единица за всяко идентифицирано секвенирано растение. За анализ надолу по веригата са запазени само съвпадения с най-малко 97% идентичност с референтната последователност. Софтуерният метагеномен анализатор v 4 (MEGAN, Huson et al., 2016) е използван срещу таксономичната рамка на NCBI за картографиране и визуализиране на резултатите от BLAST, като се запазват всички параметри по подразбиране за алгоритъма за присвояване на LCA, с изключение на минималния праг на битова оценка, който беше определена на 1%. За rbcL конвейерът за анализ се различава леко, тъй като не очаквахме област на припокриване между сдвоените четения на последователност с тях

Ампликони с дължина 550 bp. Вместо това използвахме персонализиран скрипт, за да обърнем допълването на четене 2 и да комбинираме с четене 1, за да образуваме rbcL последователност, започваща и завършваща с последователностите на праймера, но имаща поне 50 bp празнина в средата. Преди да извършим търсенето BLAST, ние също така групирахме дерепликираното и нехимерно при 97% сходство на последователността, използвайки командите “cluster_fast” в usearch. Благодарение на ограничената референтна база данни за растенията от района на Хималаите, успяхме да идентифицираме растенията само на ниво род. Надеждността на всяка молекулярна оперативна таксономична единица (mOTU), съответстваща на конкретен растителен род, беше допълнително оценена спрямо публикуван списък с растения, докладвани от района на изследване (Bhattacharya, Sathyakumar, & Rawat, 2007; Rai, Adhikari, & Rawat, 2012), и онлайн растения [напр. база данни за флора Хималаи (http://www.leca.univ-savoie.fr/db/florhy/infos.html), Добремез и др., [Връзка]] и бази данни за биологичното разнообразие [напр. Глобален инструмент за информация за биологичното разнообразие (https://www.gbif.org/)], който предоставя информация за котата и географския обхват на растителния род. Растителните родове, за които не се съобщава от района на Хималаите, не бяха разгледани за допълнителен анализ.

2.4. Информация за екологични и еволюционни връзки между растенията в диетата на Ройл

Способността за адаптация, екологичните изисквания, физиологията и хранителните качества на растенията често зависят от техните фотосинтетични пътища (C3, C4 или метаболизма на Crassulacean acid [CAM]; Ehleringer & Monson, 1993). Фотосинтетичният път на растенията, принадлежащи към един и същи род, често се счита за един и същ (Osborne et al., 2014; Sage, 2016). Следователно, ние получихме информация за фотосинтетичните пътища на хранителните растения pika от публикувани източници (Ge et al., 2012; Osborne et al., 2014; Bhattacharyya & Ray, 2015; Sage, 2016), както и информация за еволюционния произход (напр. Ендемичен до Хималаи, тропически и холарктически) средният диапазон на разпределение на горната и долната височина на всеки род диетични растения е получен от флората на базата данни на Хималаите (http://www.leca.univ-savoie.fr/db/florhy/infos.html; Добремез и др. [Връзка]), Глобален инструмент за информация за биологичното разнообразие (https://www.gbif.org/search) и онлайн портал на IUCN за червения списък на застрашените видове (http://www.iucnredlist.org/).

2.5. Статистически анализ

2.5.1. Растителен състав и сезонна динамика в диетата

2.5.2. Моделиращ ефект на местообитанието на талус върху богатството на диетите

В сезона на предсезонния сезон установихме значителни разлики между обектите в дела на семейството растения във фекална проба (GLM: F 2 = 126,92, p 1), като NAN има значително нисък брой растителни семейства (t = −4,18, p 2 = 9,51, df = 1, p 2). Сравняването на наличието на храна в околната среда с диетичните резултати разкрива, че пиката на Ройл предпочита разклонения (напр. Potentila) пред храсти (напр. Viburnum) в местообитание на талус по време на сезона на предсезоните в TUN (ламбда = 0,019, p 0,05). Като цяло анализът на състава на растителните типове в околната среда и пробите от фекалии в обектите по време на пред- и следобед показва голямо предпочитание към разклоненията (предсезон: ламбда = 0,008, р> 0,01; постмонсон: ламбда = 0,10, р> 0,001). Поради ниския размер на пробата в RUD, не е проведено сравнение на растителността по места.

Богатство на растителна диета в градиент на надморска височина в предмусонния период (Premon) и постмусонния сезон (Postmon) (HAK: Har ki doon; MAD: Madmaheshwar; NAN: Bedni ‐ roopkund; RUD: Rudranath; TUN: Tungnath; пълни подробности за сайтовете за проучване са предоставени на фигура 1) [Цветна фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

Висок дял (> 50%) от растителните родове (напр. Anaphalis и Berberis) се открива както в предсезонната (TUN = 52,02%, MAD = 56,25% и NAN = 56,67%), така и в postmonsoon (TUN = 53,48%, RUD = 64,28% и HAK = 56,66%) сезони са ендемични за района на Хималаите, последвани от растения с холарктически произход (напр. Deschampsia, Festuca; предсезон: TUN = 22,97%, MAD = 28,12% и NAN = 25,0%; postmonsoon: TUN = 26,35%, RUD = 21,42% и HAK = 26,66%) (Фигура 3 A, B; Таблица S2). Горната граница на разпространение на повече от 90% от всички диетични растения преди и след смъртта е била 3 ​​500 m и повече (Фигура 4). Установено е, че значителни пропорции на димните растения с предсезонна (TUN = 77,70%, MAD = 75,32% и NAN = 72,8%) и постмозонни (TUN = 74,49%, RUD = 80,00% и HAK = 97,14%) имат по-нисък надморски диапазон от 2000 m до 1000 m (Фигура 5). Растенията С3 съставляват 97,5% от диетата на пикас, като много по-малки пропорции са С4 (1,25%) и САМ (1,25%; Таблица S2).

Еволюционен произход на растенията на гранули, взети в пробната музонна (а) и постмосонната (б) диета на Ройл пика в западната част на Хималаите (Калифорния: Centrasiatic; EH: Хималайски ендемит; HO: Холарктика; MA: Югоизточна Азия Малайзия; SJ: китайско японски или източен азиатски; TR: тропически; YU: югоизточен китайски; подробности за проучваните места са дадени на фигура 1)

Горна граница на разпространение на растения, открити на проба в премусонна (а) и след мусонна (б) диета на Ройлесовата пика през кота (Ниска = 2 500–3 500 m; Средна = 3 500–4 500 m; Висока = 4 500–6 000 m; подробности от обектите за изследване са представени на фигура 1)

Долна граница на разпространение на растенията, открити в премусонна (а) и след мусонна (б) диета на Ройл пика през кота (Ниска = 500-1000 м; Средна = 1000-2000 м; Висока ≥ 2000 м; подробности за проучваните места са представени на фигура 1)

3.2. Ефект на местообитанието на талус върху богатството на растителната диета

Средна оценка на модела, получена от набора от 90% модел, се съгласува с най-добрия приблизителен модел с две променливи: покритие на талус и дълбочина на цепнатините, които бяха открити като значими предиктори за богатството на диетата; всеки със стойности на RI 1,0. Районът на Talus оказва значително положително влияние върху растителното богатство. Дълбочината на пукнатините обаче показва отрицателно влияние върху богатството на растенията (Таблица 2).

Таблица 2

Индия държи 28% от флората, която е ендемична за района на Хималаите (Chitale, Behera и Roy, 2014). Открихме висока зависимост на Royle's pika от ендемични растения и 53% –64% от диетичните растителни родове (напр. Geum и Fragaria) са ендемични за района на Хималаите. Повишаването на лятната температура и валежите и честотата на замръзване-размразяване се очаква да окажат вредно, многоизмерно и пространствено променливо въздействие върху тези ендемични алпийски растения (Dolezal et al., 2016). Последните изследвания показват, че до 2080 г. намаляването на разпространението на ендемични растения в различни горещи точки за биоразнообразие в Хималаите е около 23,9% до 41,34% (Chitale et al., 2014). Следователно, промените в разпространението и изобилието на хималайските ендемични растения могат да имат значително отрицателно въздействие върху цялостната хранителна екология на Ройковата пика. Липсата на растителна генетична справочна библиотека от района на Хималаите, особено от нашия сайт за проучване, не ни позволи да постигнем идентификация на видовата диета на ниво видовете. Необходими са бъдещи изследвания за изграждане на справочна библиотека за растителни генетични ресурси, за да се получат прозрения на ниво растителни видове.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Това е първото изследване на диетата на Ройл с пика, използващо ДНК метабаркодиране и успешно разкрива предпочитанията за хранене при това чувствително към климата тревопасно животно. Успяхме да определим количествено богатството на родовете в диетата на пика в различни местообитания и на различни височини. Ние разкрихме високата зависимост на пика от растения С3 и растения, ендемични за района на Хималаите. Показахме, че сезонните различия в диетата са свързани с височината и че диетата варира на различните места поради разликите в топографията и климата. Значително количество (> 89%) от диетата на пика се състои от разклонения. Богатството на родовете в диетата е силно предсказано от размера на талуса, който е на разположение на пиката за храна, с големи площи, водещи до най-високите нива на разнообразие, наблюдавани в диетата. Дълбочината на пукнатините влияе отрицателно върху богатството на растителната диета поради повишен риск от хищничество. Продължителното повишаване на температурата може да има значителен ефект върху разпространението на растенията С3 и да намали количеството налични растителни видове, с които пиката може да се храни, което би могло да повлияе както на броя на пиките, така и на тяхното разпространение, особено в местообитанията с по-ниска надморска височина.

ПРИНОС НА АВТОРИТЕ

S.B. събра пробите и извърши лабораторната работа. Д.А.Д. и Ф.И. ръководи проекта. S.B., H.H. и F.I. анализира данните. S.B. и Ф.И. написа ръкописа. Д.А.Д. и Х. Х. коментираха ръкописа. Всички автори одобриха окончателната версия на ръкописа.

Подкрепяща информация

ПРИЗНАВАНИЯ

Това проучване беше частично финансирано от Програмата за асоцииране на изследователските катедри по биотехнологии, Фондация Pro-Natura, Япония, и Програмата за професионални стипендии на Британската общност, Великобритания, за SB и Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship (IA/I (S)/12/2/500629) до FI. Благодарим на Националния орган за биологичното разнообразие, правителството на Индия и Министерството на околната среда, храните и селските въпроси (DEFRA) във Великобритания за предоставеното разрешение за транспортиране на проби между Индия и Обединеното кралство. Благодарим на г-н Gabbar Singh Bisth за съдействието по време на полевата работа. Д-р Гавин Хорсбърг (Университет в Шефилд) любезно предостави съвети и помощ по време на лабораторната работа по метабаркодиране. Проф. Тери Бърк и членовете на лабораторията за молекулярна екология в Университета в Шефилд предоставиха полезна дискусия. Благодарим на проф. Колин Озбърн (Университет в Шефилд) за любезното предоставяне на информация за растителните фотосинтетични пътища. Бихме искали да благодарим на трима рецензенти за конструктивни коментари, които подобриха ръкописа, и на г-жа Гаятри Ананд за коректурата.

Бележки

Bhattacharyya S, Dawson DA, Hipperson H, Ishtiaq F. Диета, богата на растения С3, разкрива чувствителността на алпийски бозайник към изменението на климата. Мол Екол. 2019; 28: 250–265. 10.1111/mec.14842 [PMC безплатна статия] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]