Кристиан Дойч

1 Катедра по физиология, Медицински колеж в Джорджия, Августа, Джорджия

Вера Портик-Добос

1 Катедра по физиология, Медицински колеж в Джорджия, Августа, Джорджия

Анита Д Смит

1 Катедра по физиология, Медицински колеж в Джорджия, Августа, Джорджия

Adviye Ergul

1 Катедра по физиология, Медицински колеж в Джорджия, Августа, Джорджия

Ан М Дорънс

2 Катедра по фармакология и токсикология, Мичигански държавен университет, Източен Лансинг, Мичиган

Резюме

Хипертония, повишена кръвна глюкоза на гладно и инсулин в плазмата се развиват при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HF). Нашата цел беше да оценим ефектите от затлъстяването, започващо в детска възраст, върху сърдечно-съдовата система на възрастни. Ние предположихме, че плъховете, хранени с високочестотна диета, ще имат по-големи исхемични мозъчни инфаркти и ремоделиране на средната мозъчна артерия (MCA). Триседмични мъжки плъхове Sprague Dawley са били хранени с HF (затлъстяване) или контролна диета в продължение на 10 седмици. Мозъчната исхемия се предизвиква от MCA оклузия (MCAO). Структурата на MCA беше оценена чрез миография под налягане и активност на металопротеиназа на матрицата на мозъчните съдове (MMP), а експресията и нивата на колаген бяха измерени в съдове от плъхове, които не са подложени на MCAO. Церебралният инфаркт е по-голям при затлъстелите плъхове от контролния (46,0 ± 2,1 срещу 28,0 ± 7,5 процента от инфарктираното полукълбо, затлъстяването срещу контрола Затлъстяване, хипертония, ремоделиране на съдове, матрична металопротеиназа

Въведение

Метаболитният синдром, описан като затлъстяване, инсулинова резистентност, нарушен глюкозен толеранс, хиперинсулинемия, дислипидемия и хипертония (Reaven, 1988), увеличава риска на индивида от развитие на диабет тип 2 (Festa et al., 2000; Klein et al., 2002); честотата на които се увеличава в световен мащаб (Bagust et al., 2002; Mokdad et al., 2003). Пациентите с диабет тип 2 са изложени на повишен риск от развитие на сърдечно-съдови заболявания (Grundy et al., 1999). Важно е, че диабет тип 2 увеличава риска от инсулт и 70% от новите пациенти с инсулт имат диабет или преддиабет (Kernan and Inzucchi, 2004).

Методи

Животни

Триседмични мъжки плъхове Sprague Dawley са получени от Harlan (Indianapolis IN). Плъховете се поддържат на 12-часов цикъл светлина/тъмнина, настаняват се по два на клетка и им се позволява достъп до храна и вода ad libitum. Тези проучвания са одобрени от институционалната комисия за грижи и употреба на животните и са проведени в съответствие с ръководството на Националните институти по здравеопазване за грижите и използването на лабораторни животни. Плъховете са хранени с високочестотна диета (36% мазнини; 15,2% наситени, 20,8% ненаситени, 0,4% натрий и 0,6% калий; Bioserve, Frenchtown, NJ) в продължение на 10 седмици; те ще бъдат наричани плъхове със затлъстяване. Контролните плъхове са получавали нормален чау (4,4% мазнини; 2,5% наситени, 1,9% ненаситени, 0,39% натрий и 1,0% калий; Харлан).

Кръвно налягане

Кръвното налягане се измерва чрез маншет с помощта на RTBP1001 система за кръвно налягане на плъх-опашка (Kent Scientific, Torrington CT).

Плъховете бяха упоени с изофлуран и кислород и телесната температура се поддържаше на 37 ° С през цялата операция. MCA беше трайно запушен, използвайки техниката на интралуменална оклузия. Общата каротидна артерия беше изложена и клоните на външната каротидна артерия бяха каутеризирани. 3-0 монофилна нишка със заоблен връх беше въведена в каротидната артерия и напредна краниално във вътрешната каротидна артерия на разстояние 19 mm, измерено от раздвояването на общата каротидна артерия. Конецът беше оставен на място и плъховете бяха оставени да се възстановят. MCAO се потвърждава чрез лазерна доплерова флоуметрия (Rigsby et al., 2007a). След оклузията (24 часа) площта на инфаркта се определя количествено, като се използва оцветяване с 2,3,5-трифенилтетразолиум (TTC), размерът на мозъчния инфаркт се коригира за наличие на оток, като се използва следното уравнение,% инфарктирано полукълбо = ((VL -VC)/VC) * 100, където VL е обемът на увреденото полукълбо, а VC е обемът на контролното полукълбо (Swanson et al., 1990).

Функция и структура на MCA

Хомогенизиране на тъкани и зимография

Съдовете, използвани за зимография, са получени от наивни плъхове, които не са били подложени на MCAO. Мозъчно замразени мозъчни съдове (MCA, предна и задна комуникационна и офталмологична артерии) се поставят в модифициран радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) буфер (50 mmol/l Tris-HCl, 1% Nonidet P-40, 0,25% Na-дезоксихолат, 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l фенилметилсулфонил флуорид, 1 μg/ml апротинин, 1 μg/ml левпептин, 1 μg/ml пепстатин, 1 mmol/l натриев ортованадат и 1 mmol/l натриев флуорид) и облъчен с общ протеин измерено по метода на Брадфорд (BioRad, Ричмънд, Калифорния). Пробите (20 μg протеин/проба) се зареждат върху 10% желатинови зимограмни гелове (BioRad) и се разделят чрез молекулно тегло при нередуциращи условия. След това геловете се изплакват два пъти в 2,5% Triton X-100 и се инкубират за 24 h в субстратен буфер, съдържащ 21 mmol/l Tris-HCl, 10 mmol/l CaCl2, с Coomassie blue R-250, последвано от и 0,04% NaN3. След това геловете се оцветяват, оцветявайки се в 55% метанол и 7% оцетна киселина. Литичната активност се разглежда като ясни ленти на тъмносин фон и се определя количествено чрез денситометричен анализ (Gel-Pro версия 3.1; Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Калейдоскопните протеинови стандарти (Bio-Rad) и рекомбинантен MMP-2 протеин (Calbiochem, Сан Диего, Калифорния) се провеждат паралелно с всички проби.

Колагенови слотове и Western blots

Пробите, произведени за зимография, бяха използвани за вестерн и прорези. За петна от слотове, 40 μg протеин се прилага директно върху PVDF мембраната чрез филтриращ колектор. За Western blots пробите бяха електрофоретично прехвърлени в PVDF мембрана след SDS-PAGE. След блокиране, мембраните се инкубират с първични антитела срещу колаген I или IV (петна от слотове) или MMP-13 (Western blot), последвани от HRP свързано вторично антитяло. Протеиновите ленти се визуализират с ECL и се определят количествено чрез денситометрия. Мембраните бяха отстранени и повторно изследвани за актин и резултатите бяха коригирани за експресия на актин.

Статистика

Всички резултати са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. Данните за структурата на MCA и кривите на реакция на концентрация бяха анализирани чрез двупосочни повторни измервания ANOVA с Bonferroni пост-тест. Кръвното налягане, големината на мозъчния инфаркт, телесно тегло, миогенен тонус, L-NAME индуцирана контракция и β-коефициенти бяха сравнени с помощта на t-тест на Student. Стойността на р ≤ 0,05 се счита за значима.

Резултати

Размер на мозъчния инфаркт

Плъховете със затлъстяване са значително по-тежки от контролните плъхове (390,4 ± 7,7 срещу 325,6 ± 9,1 грама затлъстели спрямо контрола p Фигура 1). Систоличното кръвно налягане се повишава при затлъстелите плъхове в сравнение с контрола (161 ± 2 срещу 137 ± 2 mmHg със затлъстяване спрямо контрола p Фигура 2А и В). Съдовете от плъхове със затлъстяване не проявяват засилен капацитет за генериране на миогенен тонус (Фигура 2С) и намаляването на диаметъра на лумена в отговор на L-NAME не се различава между двете групи (22 ± 5,3 срещу 27 ± 6,9 μm, затлъстяване срещу контрол). Структурата на MCA беше измерена при нулев поток и без калций. Просветът на MCA и външният диаметър са намалени при затлъстелите плъхове в сравнение с контролата (Фигура 3А и В). При най-високото вътрешно луменно налягане луменът и външният диаметър са приблизително 20 μm по-малки при затлъстелите плъхове. Това беше придружено от приблизително 3 μm увеличение на дебелината на стената на съда (Фигура 3C) и 30% увеличение на съотношението стена/лумен (Фигура 3D) при затлъстелите плъхове. Съдовете от плъховете със затлъстяване са по-малко приспособими от контролните съдове, както се вижда от изместване наляво в кривата стрес/петно ​​(Фигура 4А). MCA от плъхове със затлъстяване също са по-твърди от съдовете от контролните плъхове, както е показано от увеличаването на β-коефициента за съдовете (Фигура 4В).

мозъчните

Плъховете са хранени с HF или контролни диети в продължение на 10 седмици, започвайки от 3-седмична възраст. Кривите на реакция на концентрация на 5-HT (A) и ADP (B) бяха генерирани с помощта на малък артериограф на съда. Способността на MCA да генерира тон също е оценена с помощта на миограф под налягане (C) (n = 8 за двете групи).

Плъховете са хранени с HF или контролни диети в продължение на 10 седмици, започвайки на 3-седмична възраст, MCA лумен (A) и външен диаметър (B), дебелина на стената (C) и съотношение стена/лумен (D) се оценяват в рамките на интралуменал налягания при използване на малък артериограф на съда при нулев поток и условия без калций (n = 15 за затлъстели и n = 16 за контрол, # = p Фигура 5А). Експресията на активна MMP-13 е намалена с 50% в мозъчните съдове от затлъстелите плъхове, докато експресията на proMMP-13 е непроменена (Фигура 5В). Налице е значително увеличение на нивото на колаген 1 в мозъчните съдове от затлъстелите плъхове (Фигура 5С) и няма промяна в нивото на колаген IV (Фигура 5D).