Джунджи Хошиба

* Департамент за животински ресурси, Център за научни изследвания, Университет Окаяма, Окаяма, Япония

Резюме

Недостигът на n-3 мастни киселини е постигнат чрез използването на метод на изкуствено отглеждане, при който кученцата на мишките ICR са хранени на ръка с дефицитна диета, започвайки от втория ден от живота. Имаше 51% загуба на общия DHA на мозъка при мишки с диета с дефицит на n-3 мастни киселини в сравнение с тези с диета, достатъчна в n-3 мастни киселини. Адекватни и дефицитни мишки с N-3 мастни киселини не се различават по отношение на двигателната активност в теста на открито или в поведението, свързано с безпокойството в повишения плюс лабиринт. Мишките с дефицит на мастна киселина n-3 демонстрираха нарушено учене във версията с референтна памет на кръглия лабиринт на Barnes, тъй като прекарваха повече време и правеха повече грешки в търсене на тунел за бягство. Не се наблюдава разлика в ефективността между всички диетични групи във версията с реплика и работна памет на лабиринта Barnes. Това показва, че мотивационните, двигателните и сензорните фактори не допринасят за референтното увреждане на паметта.

Въведение

Методи

Животни и диетични процедури

Тестване на поведението

Поведенческите тестове започнаха на 7 седмици. Мишките и в двата експеримента бяха подложени на тест на открито поле и повишен плюс лабиринт. При първия експеримент беше приложена версията с референтна памет на лабиринта на Barnes, а във втория експеримент бяха използвани версиите с лабиринт на Barnes с работна памет и реплики.

Тест на открито

За да се оцени спонтанната двигателна активност, мишките бяха поставени в центъра на апарат с открито поле (56 × 56 cm; Lafayette Instruments, Lafayette, IN). Апаратът на открито е снабден с 32 инфрачервени фото лъча в стените и 9 дупки в пода (също оборудвани с фото лъчи), което позволява автоматизиран регистър на различни параметри на амбулация (локомоторна активност), отглеждане и търсене на дупки (проучвателна дейност) . Тези параметри бяха записани за период от 60 минути.

Повишен плюс-лабиринт

За да се измери поведението, свързано с безпокойството, се използва повишен плюс-лабиринт (Lafayette Instruments, Lafayette, IN). Плюс-лабиринтът беше издигнат на 70 см над пода и се състоеше от две отворени и две затворени рамена със същия размер (35 × 5 см); затворени ръце бяха заобиколени от стени с височина 15 см. Ръцете бяха изградени от черни акрилни плочи, излъчващи се от централна платформа (5 × 5 см), за да образуват знак плюс. Лабиринтът беше оборудван с 36 инфрачервени фото лъча, което позволяваше измерване на времето, прекарано в отворени и затворени рамена и броя на влизанията в отворени и затворени рамена. Греди, монтирани на ръба на отворените рамена, уловиха обекта, окачил главата му над ръба.

Кръгов лабиринт на Барнс

За да се запознаят мишките с лабиринта и съществуването на евакуационния тунел, те бяха подложени на една сесия за привикване преди началото на тестването. Изпитанието за привикване беше започнато чрез поставяне на животното в центъра на лабиринта под кофа в стая, която беше ярко осветена и богата на последователно разположени пространствени сигнали. След 1 минута кофата се повдигна и на мишката беше позволено да изследва лабиринта. Ако през следващите 3 минути не успее да намери евакуационния тунел, той се води там. След като влезе в евакуационния тунел, на животното беше позволено да остане в тунела за 1 минута.

Версия с референтна памет (експеримент 1)

На следващия ден след сесията за привикване бяха проведени реални тестови опити при идентични условия, с изключение на това, че мишките трябваше да намерят сами евакуационния тунел. На животните се даваха две опити на ден с интервал от 3 минути между опитите. Всяко изпитание приключи, когато мишката влезе в тунела на вратата или след изтичане на 3 минути. Резултатите за всяко животно се осредняват ежедневно между двете опити. Всички повърхности бяха рутинно почиствани със сапунен разтвор след всяка пътека, за да се елиминират възможните обонятелни сигнали от предходните животни. Мишките бяха обучени да локализират евакуационния тунел в продължение на 16 последователни дни. Десет дни след последното тренировъчно изпитание, мишките бяха повторно тествани, за да се оцени задържането на паметта. Положението на целевата дупка беше същото като по време на тренировъчния период.

Във версията на работната памет (експеримент 2) на лабиринта на мишките се даваха 4 опита на ден, за да научат позицията на тунела, но на следващия ден той беше променен на ново място. Имаше 15-минутен интервал между опитите за всяко животно. Мишките бяха тествани в продължение на 6 дни в тази версия на лабиринта и резултатите бяха усреднени за всяко изпитване между дните на тестване. Резултатите (латентности и грешки) са изразени като процент от първоначалното изпитване за всеки индивид и след това са изчислени средните стойности на групата за всяка експериментална група.

Cued версия (експеримент 2)

След едноседмичен интервал от края на тестването на работната памет, мишките бяха тествани върху версията на лабиринта (5 дни обучение). В този случай лабиринтът беше заобиколен от бяла плакатна платка (висока 20 см) и местоположението на тунела за бягство беше обозначено с черна вертикална ивица с широчина 3 см, нарисувана на дъската. На дъската имаше и други реплики в лабиринта - кръг, триъгълник и квадрат, чиито позиции оставаха постоянни по време на експеримента. Местоположението на ивицата се променяше от ден на ден, тъй като показваше новата позиция на тунела. Както във версията с референтна памет, на мишките се даваха по две опити на ден с интервал между следите от 3 минути. Резултатите за всяко животно се осредняват ежедневно за двете опити.

Анализ на мастните киселини

Мишките бяха обезглавени в края на изследването (на възраст 20 седмици); мозъците бяха бързо отстранени и подложени на пълна липидна екстракция чрез модификация на метода на Folch [24]. Общият липиден екстракт се трансметилира с 14% BF3-метанол при 100 ° С в продължение на 60 минути чрез модификация на метода на Морисън и Смит и метиловите естери, анализирани чрез газова хроматография, както е описано по-горе [25].

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на Statistica 7 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK) за извършване на повтарящи се мерки ANOVA с диета като фактор между групите и дни (блокове) като фактор в рамките на групи (повторен). Тестът на Tukey е използван за провеждане на допълнителни post-hoc сравнения между експерименталните групи, където е посочено.

Резултати

Мишките N-3 Def не се различават значително от животните n-3 Adq по външен вид или телесно тегло. Всички експериментални групи са били еднакви по телесно тегло до 13 седмици. Започвайки на 13 седмици, отглежданите с язовири мишки са имали по-ниско телесно тегло от двете AR групи. Тази разлика в телесното тегло се наблюдава до края на експеримента, когато мишките бяха убити и техните тъкани бяха събрани за анализ на мастните киселини (20 седмици).

Имаше значителни разлики в общото съдържание на n-6, общо n-3 и общото съдържание на мононенаситени мастни киселини в мозъка сред трите диетични групи, но няма значителни разлики в общите наситени мастни киселини (Таблица 2). Методът на изкуственото отглеждане е бил полезен при бързо производство на животно с ниско ниво на DHA в мозъка при мишки, хранени с мляко n-3 Def, вероятно поради намаляване на натрупването на DHA в периода на развитие. Имаше значителна разлика в DHA на мозъка сред трите групи [F (2, 41) = 202, p *

Диетична група Язовир (n = 16) n-3 Adq (n = 14) n-3 Def (n = 14)
Мастни киселини
Общо наситени40,8 ± 0,241,9 ± 0,5641,8 ± 0,25
Общо мононенаситени25,8 ± 0,4 a 23,4 ± 0,74 b 23,4 ± 0,40 b
18: 2n60,5 ± 0,01 a 0,5 ± 0,02 a 0,4 ± 0,02 b
20: 4n67,1 ± 0,12 a 7,9 ± 0,16 b 9,0 ± 0,14 c
22: 4n62,2 ± 0,05 a 2,4 ± 0,04 b 3,7 ± 0,04 c
22: 5n60,2 ± 0,01 a 0,3 ± 0,01 a 6,5 ± 0,19 b
Общо n-6 PUFA10,7 ± 0,14 а 11,7 ± 0,17 b 19,9 ± 0,26 c
18: 3n30,1 ± 0,003 a 0,1 ± 0,004 a 0,04 ± 0,003 b
20: 5n30,1 ± 0,004 a 0,1 ± 0,01 b ND c
22: 5n30,3 ± 0,01 a 0,2 ± 0,01 a 0,1 ± 0,02 b
22: 6n314,6 ± 0,32 а 15,7 ± 0,35 b 7,7 ± 0,20 c
Общо n-3 PUFA15,0 ± 0,32 а 16,1 ± 0,36 b 7,9 ± 0,20 c
22: 5n6/22: 6n30,01 ± 0,001 a 0,02 ± 0,001 a 0,8 ± 0,03 b
n-6/n-30,7 ± 0,01 a 0,7 ± 0,01 a 2,5 ± 0,07 b
Общо мастни киселини (μg/mg)41,3 ± 0,4639,2 ± 0,4941,0 ± 0,44

върху

Фигура 2А. Избягване на латентност (средно за всички тренировъчни дни) във версията на работната памет на лабиринта Barnes. Стойностите са дадени като средни стойности + SEM, където индивидуалните стойности са изразени като процент от средната стойност на пробата 1. Повтарящите се мерки ANOVA разкриват значителен ефект от пробата (F (3,20) = 6,90, p 0,05), нито значително взаимодействие между диета и проба (F (6,40) = 0,33, p> 0,05).

Фигура 2Б. Честота на грешки (средно за всички тренировъчни дни) във версията на работната памет на лабиринта Barnes. Стойностите са дадени като средни стойности + SEM, където индивидуалните стойности са изразени като процент от средната стойност на пробата 1. Повтарящите се мерки ANOVA разкриват значителен ефект от пробата (F (3,20) = 8,33, p 0,05), нито значително взаимодействие между диета и проба (F (6,40) = 0,62, p> 0,05).

Дискусия

N-3 Adq и n-3 Def мишките не се различават по телесно тегло или локомоторни параметри, докато отглежданите язови мишки демонстрират по-ниско телесно тегло и повишено движение в сравнение с двете изкуствено отглеждани групи. Разликите в телесното тегло на групата с отглеждани язовири в сравнение с AR групите може да са свързани с по-високата двигателна активност на отглежданата язовирна група или свързани със стреса в развитието на AR групите поради лишения от майката. Друго възможно обяснение е различното разделяне на мастната и чистата телесна маса.

Нашите резултати показват, че дефицитът на n-3 мастни киселини засяга пространственото обучение в лабиринта на Barnes. Нещо повече, беше забележително, че имаше и значително взаимодействие с Diet X Days, което показва, че скоростта на учене при дефицитните мишки е намалена. Лабиринтът на Барнс е подобен на водния лабиринт на Морис, тъй като е зависима от хипокампус когнитивна задача, която изисква пространствена референтна памет [19, 20]. Тези открития потвърждават и разширяват предишни наблюдения, че изчерпването на мозъчната DHA води до лошо представяне във водния лабиринт на Morris [15, 16, 17, 18]. Интересното е, че е установена положителна връзка между съдържанието на DHA в мозъка и ефективността във водния лабиринт на Морис [16].

Въпреки че лабиринтът на Барнс е донякъде подобен на водния лабиринт на Морис, лабиринтът на Барнс предлага предимството, че е по-малко стресиращ и физически по-малко облагащ от водния лабиринт на Морис. Посочен е избор на по-малко стресиращ тест за изследване на тези диетични групи, тъй като има някои доказателства за участие на DHA в стресовите реакции [26, 27]. По-рано демонстрирахме, че n-3 Def мишките са по-уязвими към стрес, тъй като се държат подобно на n-3 адекватни мишки при нормални условия, но са значително по-тревожни при стресови условия в повишения плюс лабиринт [27]. Ако повишеното ниво на тревожност и емоционалната реактивност всъщност са отговорни, поне отчасти, за лошото обучение във водния лабиринт на Морис, тогава този ефект трябва да бъде смекчен при по-малко стресиращ тест, например в кръговия лабиринт на Барнс. Наблюдението, че в тази по-малко стресираща мярка остава дефицит в изпълнението на пространствената задача, предполага, че загубата на DHA в мозъка също променя познанието.

Когато мишките бяха повторно тествани в лабиринта на Барнс 10 дни след последната тренировъчна сесия, всички експериментални групи се представиха еднакво добре, което показва, че състоянието на n-3 мастни киселини не променя запазването на пространствената памет.

За да се изследва дали дефицитът на ефективност, наблюдаван при мишките n-3 Def, може да бъде свързан със сензорни, двигателни или мотивационни атрибути на животните, мишките бяха тествани във версията на Barnes Maze. В тази задача n-3 Adq и n-3 Def мишките изискват същото количество време, за да намерят евакуационния тунел, докато отглежданите в язовири мишки са по-бързи от двете изкуствено отгледани групи. По-кратките латентни изходи на отглежданата язовирна група може да са свързани с тяхната по-висока локомоторна активност и по този начин може да не представляват реално подобрение в обучението. Това тълкуване е в съответствие с липсата на разлики в процентите на грешки. Сходството на групите n-3 Adq и Def във версията на лабиринта Barnes ни позволява да изключим сензорни, двигателни или мотивационни компоненти от възможните причини, отчитащи дефицита в пространственото обучение, наблюдаван при мишките n-3 Def.

Нашите данни не показват разлики между n-3 Adq, n-3 Def и отглежданите язовири мишки във версията на работната памет на лабиринта Barnes, въпреки забележимите разлики в DHA състоянието на мозъка. Тази констатация е в съответствие с предишен доклад относно изпълнението на водния лабиринт на Морис на изкуствено отгледани плъхове във версията на работната памет на задачата, при която изследователите не са установили връзка между поведението с широк диапазон на DHA на предния мозък и нива на арахидонова киселина ]. Беше донякъде озадачаващо обаче, че дефицит в изпълнението на задачата за работна памет на водния лабиринт на Морис се наблюдава след две поколения хранителни ограничения с n-3 мастни киселини [28]. Тези задачи само показват, че няма груби смущения в работната памет, но може да се наложи по-чувствителна методология за по-пълна оценка на работната памет.

В заключение, това проучване демонстрира за първи път дефицит в пространственото обучение на мишки с дефицит на n-3 мастни киселини, използвайки версията с референтна памет на кръговия лабиринт на Barnes. Не се наблюдава въздействие на ограничението на n-3 мастни киселини върху версията на лабиринта на Barnes, което предполага, че мотивационните, сензорните и двигателните фактори не са критични при лечението на ефектите върху референтната памет.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Програмата за вътрешни изследвания на Националните здравни институти, NIAAA.

Бележки под линия

Отказ от отговорност на издателя: Това е PDF файл на нередактиран ръкопис, който е приет за публикуване. Като услуга за нашите клиенти ние предоставяме тази ранна версия на ръкописа. Ръкописът ще бъде подложен на редактиране, набиране и преглед на полученото доказателство, преди да бъде публикуван в окончателния си вид. Моля, обърнете внимание, че по време на производствения процес могат да бъдат открити грешки, които биха могли да повлияят на съдържанието, и всички правни откази от отговорност, които се отнасят до списанието, се отнасят до.