Джанмин Ран

1 Катедра по ендокринология, Болница на Червения кръст в Гуанджоу, Медицински колеж на Университета Дзинан, № 396 Tong Fu Zhong Road, Гуанджоу 510220, Китай

Джин Ма

1 Катедра по ендокринология, болница на Червения кръст в Гуанджоу, Медицински колеж на Университета Дзинан, № 396 Tong Fu Zhong Road, Гуанджоу 510220, Китай

Ян Лиу

2 Катедра по нефрология, болница на Червения кръст в Гуанджоу, Медицински колеж на Университета Дзинан, № 396 Tong Fu Zhong Road, Гуанджоу 510220, Китай

Ронгшао Тан

3 Клиничен институт по хранене, болница на Червения кръст в Гуанджоу, Медицински колеж на Университета Дзинан, № 396 Tong Fu Zhong Road, Гуанджоу 510220, Китай

Houqiang Liu

1 Катедра по ендокринология, болница на Червения кръст в Гуанджоу, Медицински колеж на Университета Дзинан, № 396 Tong Fu Zhong Road, Гуанджоу 510220, Китай

Ганченг Лаос

1 Катедра по ендокринология, болница на Червения кръст в Гуанджоу, Медицински колеж на Университета Дзинан, № 396 Tong Fu Zhong Road, Гуанджоу 510220, Китай

Резюме

1. Въведение

Понастоящем диабетната нефропатия (DN) е основната причина за крайния стадий на бъбречно заболяване при диабет тип 1 или тип 2. За толкова много години са изследвани редица терапевтични стратегии, включително строго контролиране на глюкозата и кръвното налягане, блокада на ренин-ангиотензин [1] и понижаване на липидите [2]. За съжаление, тези лечения само забавят бъбречната прогресия, вместо да обърнат напредъка [3]. За DN трябва да се търсят по-нови модифицируеми фактори.

Напоследък все повече изследвания показват, че хиперурикемията е тясно свързана с прогресията на DN. В проучване с напречно сечение Tseng [4] потвърждава независима корелация между серумна пикочна киселина (UA) и екскреция на албумин в урината при тайвански пациенти с диабет тип 2. В другото кохортно проучване Hovind et al. [5] установи, че нивото на UA скоро след появата на диабет тип 1 независимо предсказва риска от развитие на DN по време на средно 18-годишно проследяване. В проучване върху животни [6] тубулоинтерстициалното увреждане на мишки с диабет (db/db) значително се подобрява след лечение с алопуринол в продължение на 8 седмици. Клинично терапията с алопуринол в продължение на 12 месеца при пациенти с хиперурикемия с хронично бъбречно заболяване (ХБН) значително намалява нивата на серумната пикочна киселина (SUA) и запазва бъбречната им функция [7]. Също с алопуринол в продължение на 4 месеца, Momeni et al. [8] доказа, че отделянето на урина албумин е значително намалено при пациенти с диабет тип 2 с DN.

Въпреки своята ефикасност за понижаване на SUA, алопуринолът вероятно има очевидни странични ефекти като тежка кожна алергия. Така че хипоурикемичните агенти може да не са оптималната възможност за дългосрочно приложение при профилактика на DN. Добре установено е, че диетата с нископротеинова диета (LPD) ефективно и безопасно отслабва бъбречното увреждане и забавя влошаването на бъбречната функция при пациенти с ХБН [9]. И все пак ефектите на LPD върху прогресията на DN са противоречиви [10]. Междувременно няма доказателства, че LPD оказва влияние върху ендогенния метаболизъм на UA и съответно подобрява резултатите от DN или CKD. Следователно в настоящото проучване ние изследвахме ефектите на LPD върху in vivo синтеза и клирънса на UA, както и възможните му влияния върху бъбречната патология при диабетни плъхове, индуцирани от стрептозотоцин (STZ-), утвърден животински модел за диабет и DN.

2. Материали и методи

2.1. Подготовка на животни

Непокътнатият протокол от експеримент с животни е показан схематично на Фигура 1. По-конкретно, бяха приети осемседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Китай) с тегло 180–230 g. Четиридесет и четири плъха бяха настанени колективно (2 плъха на клетка) и хранени със стандартна чау-чау в продължение на 2 седмици и след това рандомизирани в диабетна (n = 24) и контролна (n = 20) група. За формиране на диабет, плъховете се инжектират интраперитонеално STZ (разтворен в 50 mM цитрат, PH = 4.2, Sigma, Сейнт Луис, САЩ) в единична доза от 65 mg/Kg; тези с произволни нива на глюкоза в кръвта над 16,7 mmol/L в три различни времена бяха избрани за експерименти. Контролните плъхове се инжектират само интраперитонеално със същия обем цитратен буфер.

ниско

Схематичен протокол на цялостния експеримент с животни. NPD: нормална протеинова диета, LPD: диета с ниско съдържание на протеини.

2.2. Диетична намеса и експерименти с животни

Една седмица след моделирането, плъховете бяха допълнително рандомизирани в четири диетични групи: диабетични плъхове с нормална протеинова диета (D-NPD, n = 11), диабетични плъхове с LPD (D-LPD, n = 13), контролни плъхове с нормална протеинова диета (C-NPD, n = 10) и контролни плъхове с LPD (C-LPD, n = 10). Плъховете в групата с нормална протеинова диета (NPD) са били хранени с храни, съдържащи 65% въглехидрати, 17% мазнини и 18% протеини, докато храните от групата LPD са съставени от 78% въглехидрати, 17% мазнини, и 5% от протеини (Център за животни в Медицинска лаборатория Гуангдонг, Китай). Общата калория на грам храна е еднаква между NPD и LPD (3,95 Kcal/g). Диетична интервенция, запазена в рамките на 12 седмици след моделиране, проби от жизнени показатели, кръв и урина се събират на всеки 3 седмици до края на експеримента.

Жизнено важни признаци, включително систолично кръвно налягане, диастолично кръвно налягане и сърдечна честота, са регистрирани при напълно съзнателни плъхове с помощта на индиректно оборудване за маншети за опашка (LE5002, Харвардски апарат, САЩ). След предварително затопляне на плъхове в продължение на 20 минути на плака с температура 37 ° С се записват кръвното налягане и сърдечната честота на всеки плъх.

По време на целия експеримент всички плъхове имаха свободен достъп до храни и вода; стайната светлина се завъртя с 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Двадесет и четири часа урина бяха събрани и количествено определени преди експерименталния ден, докато плъховете бяха хранени в специални метаболитни клетки. Сутринта на експеримента храните се изтегляха 12 часа преди всяка операция. Плъховете бяха жертвани след 12 w диетични процедури; бъбреците бяха отстранени за хистологични и имунохистобиохимични анализи. Всички изследвания върху животни са одобрени от етническия комитет на университета Дзинан.

2.3. Биохимични анализи

Серумните концентрации на глюкоза, триглицериди, общ холестерол, пикочна киселина (SUA), урея азот (BUN) и креатинин (SCr) бяха измерени чрез съответни търговски комплекти на автоматична биохимична машина (ECHO, ECHO, Италия). Двадесет и четиричасови проби от урина бяха събрани и количествено определени. Пикочна киселина в урината (UUA), азот на урея в урината (UUN) и креатинин в урината (UCr) бяха открити от същата автоматична машина. Албуминът в урината се определя по стандартния метод на бромокрезол зелено и след това се изчислява количеството екскреция на албумин в урината (ОАЕ) за 24 часа.

2.4. Бъбречна морфология

Бъбреците на всички плъхове бяха отстранени и фиксирани в 4% параформалдехид, след това вградени в парафин и нарязани на 2 μm участъци. Разрезите бяха точно оцветени с рутинния метод за оцветяване с хематоксилин и еозин. Всички слайдове са цифровизирани и обработени от специфична компютърна система (BX41, Olympus, Япония).

Гломерулната област е граничила по контура на капилярната верига и средната гломерулна област (MGA) се определя от 15 гломерули. Степента на мезангиално разширяване на всяка група се изчислява като суми от оценката на всяка степен на пролиферация [11]. Тръбното увреждане се оценява според степента на хиалинна дегенерация на тубуларните епителни клетки и се оценява количествено във всяка група, както е описано по-рано [12].

2.5. Имунохистохимия

Клетъчните експресии на тумор некротизиращ фактор α (TNF-α) и съдов ендотелен растежен фактор (VEGF) в гломерулите и тубулите бяха открити чрез имунохистохимични анализи. Парафиновите вградени секции бяха депарафинизирани и хидратирани; ендогенната пероксидазна активност беше напълно инхибирана чрез инкубация с 3% перхидрол. След това се извършва стандартно двустепенно оцветяване с имунопероксидаза и се установяват отрицателни контроли чрез заместване на всяко първично антитяло с PBS буфер. Първичните антитела за TNF-a и VEGF са и двете заешки поликлонални производни (BOSTER BIO-ENGINEERING, Wuhan, Китай). След това оцветените гломерули и тубулите бяха полуколичествено оценени от кафяви гранули чрез компютърно подпомогната светлинна микроскопия (BX41, Olympus, Япония) в скала 1–4 [13]: нито една вътреклетъчна гранула не беше оценена като отрицателна и оценена като 1, светлокафявата гранула в по-малко от 10% от клетките се оценява като 2, гранулата с умерен до тъмен тен в повече от 60% от клетките се оценява като 4, а други на фона на 1–3 със сигурност се оценяват като 3. Общият резултат накрая се сумира от всички плъхове от всяка група.

2.6. Статистически анализ

маса 1

Среден дневен прием на храна, прием на вода и обем урина за един плъх през целия период след диетична намеса.

N Прием на храна (g/ден) Прием на вода (mL/ден) Обем на урината (mL/ден)
C-NPD11.15,9 ± 5,024 ± 59 ± 6
C-LPD1320,4 ± 4,125 ± 49 ± 2
D-NPD1029,1 ± 6,7 † 127 ± 24 † 93 ± 32 †
D-LPD1035,7 ± 7,4 † ∗ 174 ± 30 † ∗ 98 ± 38 † ∗

Данните са изразени средно ± SD. † P Фигура 2), телесното тегло при нормални или диабетични плъхове показва нарастващи тенденции (P 0,05) и сравними между нормалните и диабетичните плъхове. NPD и LPD не са имали значително влияние върху тези жизнени показатели нито при нормални, нито при диабетични плъхове (Фигура 2).

Също както е показано на Фигура 3, индуцираните от STZ плъхове с диабет показват значително ниски нива на триглицериди и общ холестерол от моделирането до края на проучването, но LPD допълнително понижава триглицеридите вместо общия холестерол при тези плъхове. При контролни плъхове не са открити ефекти на LPD върху липидните профили.

BUN и SCr, два параметъра, отразяващи функцията на бъбречния клирънс, също бяха значително увеличени при диабетични плъхове след моделиране, но се запазиха относително постоянни от 6-та седмица. Най-високите плазмени нива на BUN и SCr при диабетични плъхове са съответно 11,7 mmol/L и 88,1 μmol/L. LPD не облекчава и двата параметъра нито при плъхове с диабет, нито при контролни плъхове (Фигура 3).

3.3. Ежедневни отделяния на урина

Както е показано на Фигура 4, дневните ОАЕ са значително увеличени при диабетични плъхове след моделиране и се поддържат постоянни по време на експерименталния курс. LPD значително отслабва високите ОАЕ при диабетични плъхове и няма никакви ефекти при контролните плъхове.

Курс от 24 часа отделяне на урина между различни групи плъхове. Плътният кръг с плътни и пунктирани линии представлява съответно групата C-NPD и C-LPD, докато кухият кръг с плътни и пунктирани линии показва данни на групата D-NPD и D-LPD съответно. Данните са изразени като средна стойност ± SD. † P 5 (a) и 5 ​​(b), диабетични плъхове, хранени с NPD (Фигура 5 (a) - (B)) или LPD (Фигура 5 (a) - (D)) показват по-тежко мезангиално разширение от контролните плъхове (Фигури 5 (а) - (А) и 5 ​​(а) - (С)). Средната гломерулна област също е увеличена при диабетични плъхове (Фигура 5 (d)). LPD предотвратява само мезангиалното разширяване (Фигури 5 (а) - (С) и 5 ​​(б)) и намалява гломерулния размер (Фигура 5 (г)) при нормални плъхове, докато не оказва ефект върху тези промени при диабетични плъхове ( Фигури 5 (a) - (D), 5 (b) и 5 ​​(d)).

3.6. Експресия на цитокини

Две установени цитокини за диабетни бъбречни увреждания, TNF-α и VEGF, бяха открити чрез имунохистохимично оцветяване. Както е показано на Фигура 6 (а), експресията на TNF-α в тубулоинтерстициалната област е по-разпространена при диабетични плъхове (Фигури 6 (а) - (В) и 6 (а) - (D)), отколкото при контролни плъхове (Фигури 6 (а) - (А) и 6 (а) - (С)). LPD значително инхибира експресията на TNF-α при диабетични плъхове (Фигури 6 (a) - (D) и 6 (b)), но не и при контролни плъхове (Фигури 6 (a) - (C) и 6 (b)). От другата страна, както е показано на фигури 6 (c) и 6 (d), VEGF е небрежно експресиран около някои артериоли. Няма разлика в експресията на VEGF между диабетни и контролни плъхове. LPD не променя изразяването си и при двата вида плъхове.

Ефекти на LPD върху експресиите на фактор на туморна некроза α (TNF-α) и съдов ендотелен растежен фактор (VEGF) в гломерули и тубулоинстициум. (а) Имунохистохимично оцветяване на TNF-α. TNF-α се изразява главно в тубулоинтерстициалната област или при контролни, или при диабетни плъхове. В сравнение с контролните плъхове ((A), (C)), диабетичните плъхове ((B), (D)) експресират по-обилно TNF-α (кафявия цвят) в тази област. LPD само значително намалява експресията на TNF-α при плъхове с диабет (d), но не и при контролни плъхове (C). (b) Количествени резултати от експресията на TNF-α в тубулоинтерстиций. (в) Имунохистобиохимично оцветяване на VEGF. VEGF понякога се експресира около някои артериоли. Диабетични плъхове ((B), (D)) изразяват сравним VEGF като контролни плъхове ((A), (C)). LPD не оказва влияние върху експресията на VEGF нито при контрола (C), нито при диабетичните плъхове (D). (г) Количествени резултати от експресията на TNF-α около артериолите. В (B) и (D) NPD се показва като (□), а LPD се показва като (■). † P Reeves WB, Rawal BB, Abdel-Rahman EM, et al. Терапевтични условия при диабетна нефропатия: бъдещи подходи. Отворен вестник по нефрология. 2012; 2 (2): 5–18. [PMC безплатна статия] [PubMed] [Google Scholar]