Резюме

Заден план

Прекомерното гестационно наддаване на тегло (GWG), което е свързано с неблагоприятни дългосрочни ефекти върху здравето на потомството, се превърна в основен клиничен проблем. Натрупващите се данни показват, че системата на яйчниците kisspeptin/GPR54 участва пряко в редица физиологични дейности. Използвахме модел на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) по време на бременността, за да изследваме функцията на яйчниците на потомството и дали е включена системата kisspeptin/GPR54.

Методи

След въвеждане на мъжкия и потвърждаване на чифтосването чрез проверка на вагинален сперматозоиден щепсел, женските плъхове бяха рандомизирани в две групи: контролна диета, наречена NCD група и диета с високо съдържание на мазнини, наречена HFD група. След раждането всички плъхове бяха променени в контролна диета и размерът на постелята беше коригиран до 12 малки на малки. Яйчниците бяха събрани за оценка на постнаталния ден (PND) 4 и PND 30. Времето на вагинално отваряне беше записано и естросната цикличност беше проследена незабавно в продължение на 2 последователни седмици. Първични гранулозни клетки и яйчници, взети от PND 4, бяха събрани за определяне на директния ефект на kisspeptin-10 (kp-10) in vitro.

Резултати

Новородените плъхове, изложени на HFD по време на бременността, са имали по-малък брой вторични фоликули в яйчника. Експресията на фоликулостимулиращ хормонален рецептор (FSHR) и kisspeptin не е променена. В препубертета броят на антралните фоликули и преовулаторните фоликули е бил повишен с намалени фоликули тип III в групата с HFD. Докато експресията на гените, свързани с овулацията, беше намалена, нивата на експресия на гените, свързани с фоликуларния растеж и гените, свързани със синтеза на стероидогенезата, бяха повишени. Значително увеличение на целувка1 иРНК и кисспептинов протеин бяха открити без промени в kiss1r иРНК и GPR54. Диетата с високо съдържание на мазнини при майките по време на бременност е довела до значително напреднало начало на пубертета и нередовен естрален цикъл при плъхове потомство. В допълнение, приложението на kp-10 води до увеличаване на жизнеспособността на първичните гранулозни клетки и увеличава размера на ооцитите.

Заключения

Излагането на HFD по време на бременността при майката е имало дългосрочен ефект върху репродуктивната функция на потомството и може да има участие в повишената система на яйчниците kisspeptin/GPR54.

Въведение

Ранната среда на живот, включително хранителния статус, играе важна роля за формирането на много аспекти на физиологията и патологията в развитието на организма и тези промени се запазват през целия живот [1]. GWG, която се различава от майчиното затлъстяване (затлъстяването преди бременността), се превърна в основен клиничен проблем, тъй като много бременни жени имат гледна точка, че плодът се нуждае от повече хранене и консумира голямо количество храни с високо съдържание на мазнини. Очевидно е, че GWG ще предизвика вътрематочна "обезогенна" среда по време на бременност и е свързана с неблагоприятни дългосрочни ефекти върху здравето на потомството, чрез процес, известен като програмиране на развитието [2]. Освен това, предишни проучвания показват, че индуцираното от диетата затлъстяване на майката или HFD след отбиването могат да причинят ранно начало на пубертета и аномалии на естроузния цикъл при женското потомство [3,4,5]. Налични са обаче ограничени проучвания за програмиране на болестта на потомството при експозиция на HFD по време на бременност само при майката, особено върху функцията на яйчниците и свързаните с тях механизми.

През последните няколко десетилетия нововъзникващите проучвания са открили kisspeptin (целувка1), изразени в антеровентрално перивентрикуларно ядро ​​и дъговидни ядра неврони действа като ключов регулатор нагоре по веригата на оста хипоталамус-хипофиза-яйчник при гризачи и хора. Kisspeptin играе незаменима роля в репродукцията, включително диференциация на мозъчния пол, начало на пубертета, секреция на гонадотропин, овулация и метаболитна регулация на плодовитостта [6,7,8,9]. Няколко проучвания обаче демонстрират, че kisspeptin и предполагаемият G протеин свързан рецептор GPR54 (kiss1r) се изразяват в различни видове тъкани, включително репродуктивна система, която упражнява своите действия по пряк или непряк начин [9]. По отношение на яйчниците, kisspeptin/GPR54 участва директно в редица физиологични дейности (развитие на фоликулите, узряване на яйцеклетките, овулация и стероидогенеза) и патологичен статус (преждевременна яйчникова недостатъчност, синдром на поликистозните яйчници и ендометриоза) [10, 11].

При PND 4 при гризачите ооцитите стават напълно заобиколени от един слой сплескани гранулозни клетки, образуващи първични фоликули. Броят на първоначалните фоликули, установени първоначално, се нарича фоликулен басейн, което показва репродуктивния потенциал на бозайниците. PND30 е друга критична времева точка по време на развитието на яйчниците при плъхове. През този период вагината още не се е отворила и фоликулите растат без овулация [12, 13].

Влиянието на HFD по време на бременността при програмиране на функцията на яйчниците на потомството и дали е включена система kisspeptin/GPR54 трябва да бъде изследвано. За да разберем риска от хронично прекомерно хранене при вътрематочно развитие, ние избрахме две важни времеви точки от неонаталния и предпубертетен период, за да проучим дали HFD на майката, прилаган върху плъхове през целия гестационен период, може да промени функцията на яйчниците на потомството.

Материали и методи

Животни и експериментален дизайн

Морфометрия

Имунохистохимичен анализ

Количествена PCR в реално време

Оценка на началото на пубертета и естрозната цикличност

От PND30, потомците се проверяват ежедневно за вагинално отваряне (признак на репродуктивна зрялост) и вагинални цитонамазки се извършват всеки ден в 08:00 ч, след като вагинално отваряне се случва в продължение на 14 последователни дни, за да се определи естрозната цикличност. Стандартът на редовен естроален цикъл е същият като предходното проучване [17]. Накратко, редовният естроен цикъл се състои от най-малко два последователни редовни естроални цикъла и естрозният етап се определя според относителното изобилие на ядрени вагинални епителни клетки, рогови епителни клетки и левкоцити във вагиналните намазки под светлинен микроскоп.

Първична култура на гранулозни клетки на яйчниците

Незрели (на възраст 21-25 дни) женски плъхове Sprague-Dawley са инжектирани с 40 IU серумен гонадотрофин Pro Injectione (PMSG) (solarbio, p9970) в мускулите. След 48 часа плъховете се анестезират и яйчниците веднага се отстраняват и се поставят в стерилен PBS без калций и магнезий. След измиване с PBS, яйчниците се нарязват на малки парченца и след това се усвояват с 0,1% колагеназа при 37 ° С в продължение на 5 минути. Гранулозните клетки във фоликулите бяха изолирани и поддържани в DMEM/F12 (Gibco), съдържащ антибиотици и 10% фетален говежди серум (FBS) при 37 ° C и 5% CO2.

Имунофлуоресцентен анализ

Когато клетъчната култура нарасне до 90–95% сливане, предметните стъкла в 6-ямковите плаки бяха извадени измити с PBS. Използвайки 4% параформалдехид за фиксиране на клетките и 0,5% Triton X-100 като проникване на клетките, предметните стъкла се блокират с 5% BSA за 30 минути при 37 ° С. След инкубиране с първично антитяло за една нощ при 4 ° С, срезовете се комбинират със специфично флуоресцентно вторично антитяло за 30 минути при 37 ° С. Накрая клетъчните ядра се оцветяват с DIPA и се визуализират с флуоресцентен микроскоп.

Оценка на клетъчната пролиферация с тест за броене на клетки-8 (CCK-8)

Първичните гранулозни клетки се посяват (10 4 клетки на гнездо) в 96-гнездови плаки за 24 h и се третират с различни дози kisspeptin-10 (kp-10, Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Belmont, CA, USA). След инкубиране в продължение на 24 часа, заменихме средата и добавихме среда без FBS 100 μL с още 10 μL CCK-8. Четири часа по-късно, 450 nm абсорбция се наблюдава от четец на микроплаки.

Анализ за инкубация на яйчниците

Яйчниците бяха взети от плъхове при PND4 и третирани в продължение на 4 дни с kp-10 (100 nM) или с инкубационна среда in vitro. Всички яйчници бяха инкубирани в продължение на 24 часа при 37 ° С с 95% кислород и 5% CO2, както е описано по-горе [18, 19]. Използваната инкубационна среда е DMEM/F12, 0,1% албамакс (Gibco), 0,1% BSA, 0,05 mg/ml L-аскорбинова киселина (сигма), 1% инсулин-трансферин-селен (сигма), допълнена с 250 U/ml от пеницилин-стрептомицин. След 4 дни инкубация яйчниците бяха фиксирани в 4% параформалдехид за морфометричния анализ на фоликулите.

Статистика

Резултатите бяха изразени като средни стойности ± SEM и анализите бяха извършени с помощта на софтуер PRISM версия 7.00 (GraphPad). Сравненията между двете групи използваха t-тест с две проби или непараметричен тест. Ефектът на HFD върху редовността на цикъла на естроуса беше тестван с помощта на теста Chi-квадрат. P стойности

Резултат

Ефекти на HFD по време на бременността върху телесното тегло и теглото на яйчниците

Фигура 1а показва теглата на HFD групата и NCD групата. След раждането размерът на постелята не се повлиява значително от излагането на майчината диета. Когато плъховете нарастват до PND70, телесното тегло все още не достига статистическа значимост между HFD плъхове и контролни плъхове. От 56-дневна възраст нататък плъховете в групата с HFD показват тенденция към по-високо телесно тегло, въпреки че няма значителна разлика между двете групи (0,05 Фиг. 1

съдържание

Ефекти на HFD по време на бременността в ранното фоликуларно развитие

Ранното фоликуларно развитие беше оценено чрез морфометричен анализ на неонатални яйчници при PND4. Фигура 2 показва представителните микрофотографии на яйчници от NCD (A) и HFD (B). След преброяване на всички видове фоликули (Фиг. 2 g), установихме, че яйчниците от контролната група имат по-висок дял на вторични фоликули, отколкото яйчниците на HFD плъхове. И в групата с HFD има по-високо съотношение на първичните фоликули, въпреки че не достига статистическата значимост (стр = 0,1431). Първичният фоликул и аретичният фоликул обаче не показват диверсификация между двете групи. Ние предположихме, че промяната в съотношението на първичните фоликули и вторичните фоликули се дължи на промените на kisspeptin и FSHR. Кисспептинът се експресира главно в ооцитите (фиг. 2 c-d), а FSHR е локализиран в гранулозни клетки (фиг. 2 e-f). Въпреки това, полуколичествената статистика показва, че няма значителна разлика в интензивността на оцветяване на kisspeptin и FSHR между HFD групата и NCD групата (Фиг. 2 h).

Ефекти на HFD по време на бременност при фоликуларно развитие в препубертета при женското потомство

За да анализираме развитието на фоликулите по време на препуберталния етап, ние изследвахме яйчниците на контролни и HFD плъхове при PND30 чрез морфометрия и го свързахме с някои нива на експресия на иРНК. Не сме преброили броя на първичните фоликули и първичните фоликули, тъй като тези фоликули са трудни за откриване, а не основната част на яйчника.

На фиг. 3 a-b са показани общите снимки на яйчниците (40X) и фиг. 3 c-d (100X) съответства на увеличението на фиг. 3 a-b. След преброяване на всички видове фоликули (фиг. 3 i), установихме, че броят на форекулите на атрезия има тенденция да се увеличава при плъховете с HFD (стр = 0,0982), докато броят на вторичните фоликули има тенденция да намалява (стр = 0,1252). Освен това се наблюдава увеличение на броя на преовулаторните фоликули и антралните фоликули на възраст 30 дни в групата с HFD. Въпреки това, фоликулите от тип III са намалени в групата с HFD.

Има няколко разлики между NCD и HFD групи в експресията на мРНК на яйчниците. Първо, яйчникът на контролните плъхове имаше по-високо ниво на експресия на иРНК на гени, свързани с овулацията, отколкото яйчникът на плъхове HFD (фиг. 3 1). Второ, при плъховете с HFD се наблюдава увеличаване на фоликуларните гени, свързани с растежа на GDF9, AMH и BMP15, като има предвид, че изразът на FSHR не е засегната (фиг. 3 к). Диетата с HFD на майката също е основната причина за увеличаване на генната експресия на гените, свързани със синтеза на стероидогенезата, в яйчниците на потомството (фиг. 3 m).

Ефекти на HFD по време на бременността върху овариалната система kisspeptin/GPR54 в предпубертета при женското потомство

Генната експресия на яйчниците целувка1 и kiss1r в препубертета е анализиран. Резултатите показаха значително повишена експресия на целувка1 иРНК в яйчниците на плъховете HFD в сравнение с плъховете NCD, докато няма значителна разлика в kiss1r експресия на иРНК между две групи (фиг. 3 п). Оперирано е имунохистохимично оцветяване за kisspeptin и GPR54, за да се открие експресията и разпределението на протеина в яйчника. Установихме, че kisspeptin се изразява силно в ооцити и гранулозни клетки с по-малко оцветяване в theca клетките (Фиг. 3 e-f). Анализът на средната оптична плътност показва, че нивата на kisspeptin са регулирани нагоре в HFD групата в сравнение с контролната група (Фиг. 3 j). В допълнение, разпределението на GPR54 (фиг. 3 g-h) е подобно на kisspeptin, докато няма значителна разлика в интензивността на оцветяването между две групи (фиг. 3 j).

Ефектът на HFD по време на бременността върху възрастта на вагинално отваряне и естрозна цикличност при женското потомство

Вагиналното отваряне е маркер за настъпване на пубертета. Плъховете, изложени на HFD по време на бременност, са имали напреднал пубертет (фиг. 4 d). По случайност HFD оказа отрицателен ефект върху естросната цикличност. Фигура 4 a-b са представителният естрозен цикъл за всяка група. Приблизително 83,3% от контролните плъхове достигнаха нормалната активност на колоездене, продължаваща 4-5 дни след отваряне на вагината, в сравнение с по-малко от 20% от потомството на майките, изложени на HFD по време на бременността (фиг. 4 в).

Директните ефекти на kp-10 върху първичните гранулозни клетки и неонаталния яйчник

Както е показано на фиг. 5, първичните гранулозни клетки, изолирани от незрели женски SD плъхове, са имунооцветени с FSHR, създателят е експресиран само в гранулозни клетки. Фигура 5 също показва, че има флуоресцентно оцветяване на kisspeptin в първично култивирани клетки, което предполага експресията на kisspeptin в клетки на гранулоза от плъх. В сравнение с контролната група, 100 nM и 1000 nM kp-10 имат подобен ефект и и двете значително увеличават жизнеспособността на гранулозните клетки след 24 часа лечение, докато 10 nM kp-10 е неефективен (Фиг. 6 д).

Имунофлуоресцентен анализ в гранулозни клетки на яйчниците. Имунохистохимично оцветяване на FSHR и kisspeptin в култивирани яйчникови гранулозни клетки на плъхове (50x). Положителни оцветяващи сигнали със специфичното антитяло към FSHR и киспспептин. Отрицателният контрол се инкубира с PBS. (н = 3)

Яйчниците бяха взети от плъхове при PND4 и третирани в продължение на 4 дни с kp-10 (100 nM) или с инкубационна среда in vitro. Както яйчниците от контролната група, така и от групата на kp-10, показват голям брой първични фоликули и също така съдържат някои първични фоликули и вторични фоликули без антрални фоликули. По-голямата част от първичните фоликули и вторичните фоликули са разположени в центъра на яйчниковата тъкан, докато първоначалните фоликули са главно разпределени в периферията на яйчниковата тъкан (фиг. 6 a-d). След измерване на размера на ооцитите, третираната с kp-10 група достигна по-голям диаметър в сравнение с ооцитите от контролните яйчници (фиг. 6 е).

Дискусия

Идентифицирани са различни видове хранителен статус на майката за програмиране на заболявания при възрастни [2]. И много доказателства демонстрират, че излагането на майката на HFD по време на бременност и кърмене има вредни ефекти върху потомството [20, 21]. В настоящото проучване ние се фокусирахме върху влиянието на излагането на майката на HFD по време на бременността, само за да имитираме прекомерното наддаване на тегло при бременност и изследвахме репродуктивния потенциал на женското потомство при PND4 и PND30. Установихме, че ранното фоликуларно развитие при новороденото и предпубертетно фоликуларно развитие при потомството е нарушено от HFD при майката по време на бременността. Точният механизъм остава неясен, но изглежда, че може да участва системата kisspeptin/GPR54.

Ефекти на HFD по време на бременността върху телесното тегло

Перинаталната среда, включително лактацията, също е много важен прозорец за програмиране, за който се смята, че играе критична роля в развитието на потомството [1]. Въпреки че кърмата се влияе главно от диетата за кърмене, неизбежно е гестационната диета също да има определено влияние върху състава [40]. Поради това е важно да се проучи съставът на хранителните вещества и хормоните в кърмата, което пренебрегнахме при проектирането на експеримента. Въпреки че има някои ограничения в настоящото проучване, ние вярваме, че това няма да промени основните ни констатации и спекулации.

Заключение

В заключение, настоящото проучване показа, че HFD по време на бременността води до промени във фоликуларното развитие в неонаталния период и предпубертета при женското потомство. Също така демонстрирахме, че групата с HFD показва напреднало начало на пубертета и нарушена естрозна цикличност. Въпреки това, дългосрочното влияние на HFD при майката върху функцията на яйчниците на потомството, като възрастен и период на стареене, трябва да бъде допълнително разкрито. Въпреки че предполагаме, че локалният яйчников киспептин може частично да обясни промяната на физиологичните процеси в яйчника и да демонстрира пряката роля на kp-10 в развитието на фоликулите, механизмът не е установен.