Cecilia Y. Cheung

1 Отдел по майчина фетална медицина, Катедра по акушерство и гинекология, Университет по здравеопазване и наука в Орегон, Портланд, Орегон,

Виктория Х. Дж. Робъртс

2 Отдел за репродуктивни науки и науки за развитието, Национален изследователски център за примати в Орегон, Портланд, Орегон,

Антонио Е. Фриас

1 Отдел по майчина фетална медицина, Катедра по акушерство и гинекология, Университет по здравеопазване и наука в Орегон, Портланд, Орегон,

2 Отдел за репродуктивни науки и науки за развитието, Национален изследователски център за примати в Орегон, Портланд, Орегон,

Робърт А. Брейс

1 Отдел по майчина фетална медицина, Катедра по акушерство и гинекология, Университет по здравеопазване и наука в Орегон, Портланд, Орегон,

Резюме

Въведение

Консумацията на диета с високо съдържание на мазнини в западен стил (HFD) по време на бременност показва, че променя метаболизма на майката и плода (Frias and Grove 2012). Свързаните високи нива на липидите причиняват вредни ефекти върху развитието на плода и плацентата, което води до дългосрочни последици за здравето (O'Tierney-Ginn et al. 2015; Roberts et al. 2015; Harris et al. 2016; Lowensohn et al. 2016; Contu и Хоукс 2017). Тези ефекти често се проявяват независимо от развитието на затлъстяване. Макар и неизследван, един потенциален фактор, допринасящ за неблагоприятните ефекти на HFD върху плода и плацентата, може да бъде необичаен обем на околоплодната течност (AFV). Добре документирано е, че промените в AFV по време на човешка бременност оказват неблагоприятно влияние върху изхода на майката и плода. Както олигохидрамнионът, така и полихидрамнионът са свързани с усложнения на бременността, включително преждевременно раждане, ниско тегло при раждане, ненормална фетална лъжа, отлепване на плацентата, следродилен кръвоизлив и раждане чрез цезарово сечение (Locatelli et al. 2004; Hamza et al. 2013; Morris et al. 2014). Този проблем обаче може да бъде сложен, тъй като бременните субекти, които са на HFD и последващо затлъстяване, често имат коморбиден гестационен диабет и това от своя страна е свързано с повишени AFVs в сравнение с нормалните (McMahon et al. 1998; Abele et al. 2012).

Въпреки че разбирането за регулирането на AFV при хората е необходимо за смекчаване на неблагоприятните ефекти на анормалните AFV върху плода и новороденото, голяма част от нашето разбиране за механизмите, които регулират AFV, са получени от проучвания върху фетални овце (Brace and Cheung 2014; Brace et al. 2014). В експерименталния модел за овце AFV се определя главно от скоростта на трансфер на течности през амниона (Brace and Cheung 2014; Brace et al. 2014). Въпреки това, регулаторите на този път на транс-амнион не са ясно установени. Аквапорините (AQP) са трансмембранни протеини, които улесняват транспорта на вода и малки разтворени вещества през полупропускливи мембрани. Наличието на AQPs в амниона показва, че те най-вероятно участват в транс-амнионния транспорт на амниотична течност (Liu and Wintour 2005; Mann et al. 2005; Beall et al. 2007). В съответствие с тази концепция е и нашата неотдавнашна констатация, че експресията на AQP1 в амниона на овцете е положително корелирана със скоростта на трансфер на течности между отделението на амниотичната течност и интрамембранозната васкулация на плода, като по този начин потенциално участва в регулацията на AFV (Cheung et al. 2016).

В това проучване, за да изследваме ефектите на HFD върху състоянието на амниотичната течност и да усъвършенстваме знанията в регулирането на AFV, ние се опитахме да определим дали HFD ще промени израженията на AFV и amnion AQP в макаци, които не са затлъстели и устойчиви към HFD. Ние предположихме, че петте AQP, изразени в човешки амнион, също се изразяват в макак амнион и че профилът на изразяване ще бъде подобен. В допълнение, ние постулирахме, че регионалните различия в нивата на иРНК на AQP ще съществуват в макак амнион. Освен това предположихме, че HFD ще намали AFV при HFD-R животни паралелно с повишена експресия на AQPs в амниона.

Материали и методи

Подготовка на животни

Всички протоколи за животни бяха одобрени от Институционалния комитет за грижи и използване на животните (IACUC) на Националния изследователски център за примати в Орегон (ONPRC) и бяха спазени насоки за хуманна грижа за животните. ONPRC спазва Закона за хуманно отношение към животните и разпоредбите, прилагани от USDA.

Бременните японски макаци (Macaca fuscata) са подложени на ултразвуково изследване при приблизително 120 дни бременност (срок = 175 дни). Накратко, след отнемане на храна през нощта се индуцира седация с 5 до 15 mg/kg интрамускулно инжектиране на кетамин. Субектите са били позиционирани в гръбначно лежане и физиологичните жизнени показатели са били наблюдавани по време на процедурата. Индексът на околоплодната течност от четири квадранта (AFI) беше измерен (GE Voluson 730 Expert; Kretztechnik, Zipf, Австрия) от един ултразвуков фотограф (AEF) и използван като индекс на AFV.

Както е описано подробно на друго място, животните се поддържат или на контролна, стандартна диета от маймуни (n = 8, 14% мазнини), или хронично на HFD (n = 10, 36% мазнини. Purina Mills, Inc., St. Louis, MO) преди и по време на бременност (Harris et al. 2016). Съставът на тази диета съставлява типична диета в западен стил по отношение на съдържанието на наситени мазнини и се съчетава в съдържанието на микроелементи със стандартната диета за контрол на чау. И двете диети са били достатъчни по съдържание на витамини, минерали и протеини за нормален растеж. В това проучване са включени само HFD животни, устойчиви на диетата. При аутопсия се получават тъкани на амнион от първичната плацента, вторичната плацента и отразения амнион. Тъй като това проучване беше едно от многобройните проучвания, които използваха този препарат от макаки, ​​не всеки регион беше на разположение за вземане на проби от всяко животно.

Бременни хора

В това проучване данните за мРНК на човешки амнион за AQP1, AQP3, AQP8, AQP9 и AQP11 са получени от субекти с нормална недиабетична бременност (n = 20), както се съобщава отчасти в нашето скорошно проучване (Bednar et al. 2015). Дизайнът на проучването е одобрен от Съвета за преглед на институцията на Университета за здраве и наука в Орегон (OHSU). Писмено информирано съгласие и разрешение за изследване на HIPPA е получено от всички субекти, участвали в изследването. Експерименталните протоколи и методологиите за количествено определяне на иРНК са описани подробно на друго място (Bednar et al. 2015).

RT-qPCR в реално време за макакови аквапорини

Нивата на AQP иРНК в макакови амниони се определят чрез RT-qPCR в реално време. Тъканите на Amnion, събрани незабавно при изваждане, бяха поставени в RNAlater ® (InVitrogen, Thermo Fisher Scientific) за екстракция на РНК с помощта на RNeasy Kit (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния).

Общата РНК (0.5 μg) е обърната, транскрибирана с помощта на MultiScribe обратна транскриптаза. Примерна cDNA се усилва, като се използват специално проектирани за мулатата Macaca специфични праймери за AQP1 (Primer Express ® Software v3.0. Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). За AQP3, AQP8, AQP9 и AQP11 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) (Таблица 1) са използвани предварително проектирани специфични за мулатата макака грундове. PES1 (пескадило рибозомен биогенезисен фактор 1) е използван като домакински ген.

маса 1

Специфични за макака мулати аквапоринови грундове a

Идентификационен номер на GeneAssay/последователност Източник
AQP1 b A189LG2 RhAQP1_110514
Напред: 5′ – CGCGGTGATCACACACAACT ‐ 3 ′
Реверс: 5′ – GGGCTCCCCCGATGAAT ‐ 3 ′ (68 bp)		 По поръчка
AQP3Rh02856041_m1 AQP3 FAMПредварително проектиран
AQP8Rh02837748_m1 AQP8 FAMПредварително проектиран
AQP9Rh02878553_m1 AQP9 FAMПредварително проектиран
AQP11Rh02887164_m1 AQP11 FAMПредварително проектиран

Статистически анализ

високо

Регионални разлики в профилите на експресия на AQP в амнион на контрола и HFD макаци. Данните, показани за всяка AQP иРНК, са комбинирани контролни и HFD групи, нормализирани до комбинираното средно ниво на AQP 1 за първичната плацента, вторичната плацента и отразения амнион (пунктирани линии). Показани са стойности на един фактор ANOVA P. * P AQP в първичен плацентарен амнион.

Регионални вариации в експресията на mQNA на AQP, разделени на контрол и HFD в първичната плацента, вторичната плацента и отразения амнион. Данните за отделни AQP се нормализират, за да означават AQP 1 mRNA ниво (пунктирана линия) от всички региони и диети, взети заедно. Стойностите на взаимодействието P са от 2-фактор ANOVA, сравняващи ефектите от диетата. ** P AQP нива на иРНК в първичен амнион на контролната диета.

Средният AFI при животните с HFD е малко по-нисък от този в контролната диетична група, но AFI в контролните (7,54 ± 0,66 cm, n = 8) и HFD (7,16 ± 0,46 cm, n = 7) животни не са статистически различен (P = 0,66). AFI не корелира с теглото на майката, независимо от състоянието на майчината диета. Когато регресира спрямо нивата на AQP тРНК, използвайки бивариантна регресия, AFI е положително корелиран с AQP11 (P = 0,0019), но не и с останалите AQP (фиг. 4). Използвайки многовариантна регресия, AFI отново корелира само с нивата на иРНК на AQP11.

Регресионни връзки между индекса на амниотичната течност (AFI) и нивото на иРНК на всеки AQP в амниона (всички региони комбинирани) на контролни (запълнени кръгове) и HFD (отворени кръгове) макаци. Плътните линии са регресионните линии, а пунктираните линии са 95% доверителен интервал около регресионната линия. Коефициентът на корелация и стойностите на P са показани за отделните AQP. Имайте предвид, че скалите по хоризонталната ос са уникални за всеки AQP.

Дискусия

В това проучване HFD изглежда е свързано с повишени нива на иРНК на AQP1 и AQP8 в макаковия амнион. Това предполага, че водният транспорт на амнион може да бъде засегнат, тъй като AQP1 е високоефективен воден канал (Agre et al. 1993) и в по-малка степен AQP8 (Koyama et al. 1998; Soria et al. 2010), за улесняване на преноса на вода . Тъй като обаче не е имало корелация между AFI и нивата на mRNA на AQP1 или AQP8 на mRNA, AQPs може да не са основният определящ фактор на AFV в макаците. Положителната корелация между AFI и AQP11 представлява интерес, въпреки че функцията за транспортиране на вода за AQP11 не е ясно установена, тъй като AQP11 се изразява предимно в тестисите с функция, която предстои да бъде определена (Gorelick et al. 2006; Yakata et al. 2011 ). Дали AQP11 ще промени значително AFV, като модифицира транспортирането на околоплодната течност, ще изисква допълнително проучване.

Акваглицеропорините AQP3 и AQP9 са трансмембранни протеини, които транспортират глицерол в допълнение към водата. Aquaporin 3 участва в транспорта на глицерол в мастните тъкани (Rodríguez et al. 2011), а AQP9 е специфичен глицеролов транспортен канал в черния дроб. Чернодробният AQP9 улеснява усвояването на глицерол за синтез на глюкоза и триглицериди, като по този начин участва в патогенезата на затлъстяването и диабета. Експресията на гена на AQP9 в черния дроб се регулира нагоре при индуцирани от стрептозотоцин диабетни плъхове (Carbrey et al. 2003) и мишки (Kuriyama et al. 2002), както и при индуцирани от диета затлъстели мишки (Hirako et al. 2016) . В настоящото проучване нивата на mRNA на amnion AQP3 и AQP9 в устойчиви на HFD макаци не се различават от тези при контролните животни. Липсата на ефект от високия прием на мазнини върху експресията на гени AQP3 и AQP 9 най-вероятно се дължи на устойчивия фенотип, при който животните остават слаби с нормална инсулинова функция. Следователно, при липса на затлъстяване и диабет, самото високо съдържание на мазнини в храната не изглежда да има значителен ефект върху генната експресия на акваглицеропорините. Освен това не е известно, че амнионът е основна тъкан, важна за липогенезата.

Настоящото ни проучване изследва връзките между нивата на иРНК на AQP на макак амнион и диетичния статус на майката. По-нататък анализирахме корелацията на AQP генната експресия и AFV в контролни и HFD групи. Нивата на генна експресия обаче може да не отразяват биологичните функции, докато протеините са ефекторите, които медиират функциите. Транслацията на гени от иРНК във функционални протеини е сложен процес, включващ множество нива на транслационна регулация, както и пост-транслационни модификации (Arcondéguy et al. 2013). Липсата на данни за протеини е потенциална ловувка в това проучване. Тъй като обаче това проучване беше едно от многобройните проучвания, които използваха този препарат от макака, като такова, количеството на наличните тъкани на амнион за настоящото проучване беше ограничено и недостатъчно за анализ на протеини в допълнение към количественото определяне на иРНК. В предишното ни проучване на генните експресии на AQP в човешкия амнион (Bednar et al. 2015) открихме умерена положителна корелация (r 2 × 100% = 32%) между AQP иРНК и нивата на протеини. По този начин, настоящите данни за генната експресия в макаците могат да предоставят ценна информация за ролята на AQP в регулирането на AFV при условия на висок прием на мазнини.

С оглед на нарастващото разпространение на HFD и затлъстяването сред общата популация е важно да се прецени дали диетата с високо съдържание на мазнини може да повлияе неблагоприятно на AFV по време на бременност. При овцете майчиното затлъстяване намалява обема на амниотична и алантоисна течност в сравнение с контролните не-затлъстели животни (Satterfield et al. 2012). В предишното ни проучване при бременни жени (Bednar et al. 2015), AFI има тенденция да намалява, тъй като ИТМ се увеличава при контролни недиабетни пациенти, въпреки че диетичният статус на тези пациенти не е известен. В това проучване, HFD при бременни макаци, които не развиват затлъстяване, не е свързано със значително намаляване на AFI и няма връзка между теглото на майката и AFI. Въпреки че изглежда, че нашите резултати показват промени в експресията на амнион AQP1 и AQP8 при условия на HFD, получените промени в транспорта на амниотична вода може да не са били отразени като промени в AFI. Като цяло, това проучване предполага, че диета с високо съдържание на мазнини без развитие на затлъстяване може да има относително незначителни ефекти върху израженията на AFV и AQP в амниона. По този начин, фенотип с висока устойчивост на мазнини при майки при липса на затлъстяване и диабет може да бъде защитен срещу някои неблагоприятни ефекти на HFD по време на бременност.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси и няма оповестявания, които да декларират.

Благодарности

Искаме да признаем експертното техническо умение на Катрин Левандовски от ONPRC за извършване на AQP RT ‐ qPCR анализ. Благодарим на Даяна Такахаши, Тайлър Дийн и пазителя на животните в ONPRC.

Бележки

Cheung C. Y., Roberts V. H. J., Frias A. E., Brace R. A . Високомаслени диетични ефекти върху обема на околоплодната течност и експресията на амнион аквапорин при нечовекоподобни примати. Physiol Rep, 6 (14), 2018, e13792, 10.14814/phy2.13792 [CrossRef] [Google Scholar]

Информация за финансиране

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства: NIH R01 HD061541 от Националния институт по детско здраве и човешко развитие, NIH R24DK0909640 от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания с допълнителна подкрепа от NIH P51OD011092. Съдържанието на това изследване е отговорност единствено на авторите и не представлява непременно официалното мнение на NIH/NICHD.