Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, администриране на проекти, писане - оригинален проект

предпазва

Присъединителен отдел по биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет в Белград, Белград, Сърбия

Роли Куриране на данни, Методология, Софтуер, Проверка

Свързана лаборатория за молекулярна биомедицина, Институт по молекулярна генетика и генно инженерство, Университет в Белград, Белград, Сърбия

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване

Присъединителен отдел по биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет в Белград, Белград, Сърбия

Разследване на роли, методология, писане - преглед и редактиране

Присъединителен отдел по биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет в Белград, Белград, Сърбия

Концептуализация на роли, надзор

Присъединителен научен ветеринарен институт „Нови Сад“, Нови Сад, Сърбия

Софтуер за роли, валидиране, визуализация

Катедра по статистика, Аграрен факултет, Белградски университет, Белград, Сърбия

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, методология, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Присъединителен отдел по биология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет в Белград, Белград, Сърбия

  • Урош Главинич,
  • Биляна Станкович,
  • Владимир Драшкович,
  • Jevrosima Stevanovic,
  • Тамаш Петрович,
  • Нада Лакич,
  • Зоран Станимирович

Фигури

Резюме

Цитат: Главинич U, Станкович B, Драшкович V, Stevanovic J, Petrovic T, Lakic N, et al. (2017) Диетичен аминокиселинен и витаминен комплекс предпазва медоносната пчела от имуносупресия, причинена от Nosema ceranae. PLoS ONE 12 (11): e0187726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187726

Редактор: Санджай Б. Джадхао, International Nutrition Inc, САЩ

Получено: 19 февруари 2017 г .; Прието: 30 август 2017 г .; Публикувано: 8 ноември 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено от Министерството на образованието, науката и технологичното развитие на Република Сърбия (грант № III46002), водено от професор Зоран Станимирович.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Nosema spp. микроспоридия често паразитират при възрастни медоносни пчели [1]. Описани са два вида: Nosema apis и N. ceranae. Многобройни доклади разкриват, че N. ceranae преобладава над N. apis, тъй като много по-голямо разпространение и много по-широко географско разпространение на първите са били наблюдавани в повечето части на света [1–9]. Инфекцията с N. ceranae засяга както отделни медоносни пчели [4,10–12], така и колонията и е свързана с нарушение на колапса на колониите - CCD [10,13–16], влияещо върху възпроизводството и продуктивността на пчелното семейство [17,18] ].

Насекомите имат здрава имунна система, за да се защитят срещу атаката на различни патогени. Тази система включва физически бариери като първа отбранителна линия и вроден клетъчен и хуморален имунитет - втора отбранителна линия [19]. Антимикробните пептиди апидецин [20], абаецин [21], хименопеецин [22] и дефензин [23], компоненти на хуморалния имунитет, допринасят много за защитата срещу микроорганизмите [24]. Вителогенинът на медоносни пчели е специфичен за жените жълтъчен протеин, който е признат за един от най-важните регулатори на имунитета и дълголетието на пчелите [25, 26]. Експресиите на гени, които кодират тези имунни протеини, са изследвани в няколко проучвания: Antúnez et al. [24] демонстрира, че експресиите на някои гени в заразените с N. ceranae пчели са значително регулирани надолу и Chaimanee et al. [27] потвърди отново имуносупресията на гостоприемника от инфекция с N. ceranae. Други патогени, например Varroa destructor [28], вируси [29,30] и ларви Paenibacillus [31], също влияят върху имунитета на медоносните пчели. Освен това някои резултати разкриват положителното въздействие на храненето върху някои аспекти на имунитета на пчелите [32,33], включително тези на поленовите хранителни вещества върху гените, влияещи върху дълголетието и производството на някои антимикробни пептиди [34,35].

Добавянето на диети в пчеларската практика е често срещано в случаи на естествен дефицит на фураж. За съжаление през последните десетилетия се наблюдава значителна загуба на естествени местообитания, което неизбежно е довело до намаляване на флористичното изобилие и разнообразие [36]. В резултат на това в много региони се появява недостиг на естествен фураж за пчели (прашец и нектар) и предизвиква необходимостта от адекватни допълнителни диети [37,38], които могат да намалят загубите на колонии чрез облекчаване на протеиновия стрес [39]. Най-често срещаните добавки за медоносните пчели са тези на основата на аминокиселини и витамини, а една от тях е "BEEWELL AminoPlus". Той се използва широко в балканските страни от 2010 г., но все още предстоят научни изследвания за влиянието му върху пчелите.

Също така няма съгласуваност между резултатите от проучвания, при които белтъчният титър в хемолимфата на медоносните пчели в клетки е използван като маркер за ефикасността на протеиновата диета: De Jong et al. [49] установи, че протеиновите добавки FeedBee ® и BeePro ® са по-ефективни от естествения прашец; Morais и сътр. [50] не са забелязали разлики между изкуствените самостоятелно приготвени богати на протеини диети и пчелния хляб; DeGrandi-Hoffman et al. [43] не съобщава за разлики между ефектите на BeePro ®, MegaBee ® и прашец от Brassica rapa; и Basualdo et al. [45] отчитат значително по-високи титри на хемолимфен протеин, но също така и по-добро оцеляване при пчелите, хранени с пчелен хляб, отколкото тези, хранени със заместител.

Съобщава се и за противоречиви резултати, като се отчита ефектът от протеиновите диети върху нивата на патогена. В работата на Basualdo et al. [45] по-голямо количество (но също и оцеляване) на N. ceranae е регистрирано при пчелите, хранени с пчелен хляб, в сравнение с тези, чиято диета е допълнена със заместител (изкуствена протеинова диета Virgen ®); обратно, DeGrandi-Hoffman et al. [43] съобщава за по-високи нива на патоген (нозема и вирус) и по-сериозни загуби на маточници и колонии в групи, хранени с добавки, особено с BeePro ® .

Като се започне от предишни открития на N. ceranae, потискащи ефекти върху имунните гени [24,27] и благоприятните ефекти на адекватното протеиново хранене върху здравето и развитието на пчелното семейство, имунния отговор, толерантността към паразитите и оцеляването [32–34,39,43 –45,51] предположихме, че „BEEWELL AminoPlus“ (хранителна добавка, много богата на аминокиселини и витамини) може да повлияе на имунитета на пчелните пчели. По този начин целта на това проучване е да се оцени потенциалът на тази добавка за защита на пчелите, компрометирани от инфекцията с N. ceranae.

Материали и методи

Тествана добавка

В това проучване беше тествана смес от витамини, минерали и аминокиселини (Таблица 1), която се продава под марката „BEEWELL AminoPlus“ (Provet, Анкара, Турция). Хранителният разтвор се приготвя съгласно инструкциите на производителя (1 ml BEEWELL AminoPlus/1 l захарен сироп).

Експериментален дизайн

Подготовка на инокулум и експериментална инфекция

Разтворът на спори се приготвя, като се използват заразени с N. ceranae пчели чрез смачкване на корема им в дестилирана вода. Наличието на N. ceranae и отсъствието на N. apis бяха потвърдени с PCR, следвайки метода, описан от Martín-Hernández et al. [11]. Спорите са преброени според Кантуел [54]. Инокулумът с минимална жизнеспособност от 99% (както се оценява с 4% трипаново синьо) беше прясно приготвен чрез смесване на спорите с 50% разтвор на захароза, за да се получи крайна концентрация от 1 х 106 спори/мл. Всички групи, с изключение на NI, са заразени с инокулум на N. ceranae на 3-ия ден след появата, според Fries et al. [55]. За да се гарантира, че всяка пчела поглъща пълната доза, се извършва индивидуално инокулиране, като се използва протоколът, описан подробно от Williams et al. [53].

Вземане на проби от пчели

Пет пчели са взети проби за екстракция на РНК по следния график: на 3-ия ден след инфекцията (p.i.) от групи I-BW1, I-BW3 (хранени с добавка до този ден) и група I; на 6-ия и 12-ия ден след заразяването от всички групи, с изключение на I-BW9, от който пчелите са събрани на 12-ия ден (Таблица 2). В същия ден на вземане на проби (Таблица 2) бяха взети проби от още пет пчели от всяка група и коремчетата им бяха индивидуално хомогенизирани в 1 ml дестилирана вода и броят на спорите на N. ceranae на пчела беше изчислен с помощта на хемоцитометър [54].

Екстракция на синтез на РНК и кДНК

Всяка единична медоносна пчела се поставя в стерилна 1,5-милилитрова полипропиленова микроепруветка с 200 μl вода (PCR клас) и се хомогенизира със стерилна еднократна пестичка за еднократна употреба (VWR, Сан Франциско, Калифорния). Общата РНК беше изолирана от всяка отделна медена пчела с Quick-RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, САЩ), следвайки инструкциите на производителя. По време на процеса на екстракция пробите са преминали през „обработка с DNase в колона“ (обработка с DNase I Reaction Mix), за да се отстранят всички замърсяващи ДНК. Общата извлечена РНК незабавно е използвана за генериране на първостепенни кДНК с помощта на RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, EU), съгласно инструкциите на производителя.

Количествена PCR в реално време

Обратната транскрипционно-количествена PCR (RT-qPCR) амплификация беше извършена с помощта на зеления метод SYBR в 20 μl реакционна смес с “KAPA SYBR® FAST Master Mix (2X) Universal” (KAPA Biosystems, САЩ), в съответствие с инструкциите на производителя . За реакция RT-qPCR бяха използвани 0.2 μM от всеки специфичен праймер. Праймерите, използвани за амплификация, са показани в Таблица 3.

Реакциите RT-qPCR бяха проведени в ротор с 36 ямки, използвайки “Rotor-Gene Q 5plex” (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Амплифицирането се извършва съгласно следния протокол: 95 ° С за 2 минути, последвано от 40 цикъла от 95 ° С за 20 s, 60 ° C за 30 s и 72 ° C за 80 s. Количественото определяне на нивата на генна експресия беше направено с помощта на 2 -ΔΔC Т метод [58]. За нормализиране на всяка генна експресия бе използван β-актин като ген за вътрешен контрол, а средната стойност на NI групата беше използвана като калибратор.

Статистически анализ

Поради хомогенността на данните (cv> 30%) бяха определени медиани и използвани непараметрични тестове. Разликите в броя на спорите на Nosema и нивата на транскрипция на гените между групите и между дните за вземане на проби бяха оценени чрез теста Kruskal-Wallis и Mann-Whitney U. За сравнение на смъртността на пчелите между групите е направен тест на Kruskal-Wallis. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуерен пакет Statistica ® (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA). P-стойностите под 0,05 се считат за значими.

Резултати

Наличие на спори на N. ceranae

Контролни проби и проби, събрани на ден 3 p.i. остава отрицателен за спорите на N. ceranae през експерименталния период. Резултатите от теста на Крускал-Уолис показват значителни разлики между броя на спорите на N. ceranae в групи на ден 6 (H = 23,629; df = 4; p Фиг. 2. Натоварвания от спори на нозема в контрола и групи, третирани с аминокиселинен и витаминен комплекс „BEEWELL AminoPlus ”на 6 и 12 ден след заразяването с N. ceranae.

Групите са заразени с спори от N. ceranae на 3-ия ден след появата им и са третирани с „BEEWELL AminoPlus“ от 1-ви (I-BW1), 3-ти (I-BW3), 6-ти (I-BW6) и 9-ти (I -BW9) ден след появата, докато контролата (I) е заразена, но не е лекувана. Различните букви означават значителни разлики между групите.

Броят на спорите е бил значително по-висок в група I, отколкото в който и да е друг, както на ден 6, така и на ден 12 п.и. Резултатите от теста на Mann-Whitney показаха, че броят на спорите при пчелите, събрани на ден 6 p.i. са били значително по-високи в контролата (I), отколкото в I-BW1 (z = 3.787; p-ият ден pi броят на спорите е бил значително по-нисък в група I-BW1, отколкото в I-BW6 (z = -2.919; p = 0.004) и I-BW9 (z = -3,785; p Фиг. 3. Нива на експресия на абаецин гена на ден 3 след инфекцията с N. ceranae в групи, третирани с аминокиселина - Витаминен комплекс „BEEWELL AminoPlus“.

Групите бяха заразени с спори от N. ceranae на 3-ия ден след появата им и третирани с „BEEWELL AminoPlus“ от ден 1 (I-BW1) и ден 3 (I-BW3), докато контролната група (I) беше заразена, но не лекувана . Различните букви означават значителни разлики между групите.

Шест дни след заразяване с N. ceranae няма значителни разлики в експресията на наблюдавани гени между пчелите, събрани от групи I, I-BW1, I-BW3 и I-BW6.

Според резултатите от теста на Kruskal Wallis на 12-ия ден п.и. нивата на иРНК са били значително различни за абаецин (Н = 13,07; df = 4; р = 0,011), дефензин (Н = 12,66; df = 4; р = 0,013), апидецин (Н = 13,09; df = 4; р = 0,11), хименоптаецин (Н = 13,83; df = 4; р = 0,008) и вителогенин (Н = 13,75; df = 4 р = 0,008) (Фигура 4). Експресията на гена на абаецин е значително по-ниска при пчели, третирани от първия ден (I-BW1) в сравнение с I-BW3 и I-BW6, и в група, лекувана от ден 9 (I-BW9), отколкото при пчели от всички останали групи . Нивата на иРНК на хименоптецин и апидецин са значително по-ниски в контролата (I), отколкото в други групи. Гените на дефензин и вителогенин бяха регулирани надолу в групи I и I-BW1 в сравнение с групи I-BW6 и I-BW9.

Групите са заразени с спори от N. ceranae на 3-ия ден след появата им и са третирани с „BEEWELL AminoPlus“ от 1-ви (I-BW1), 3-ти (I-BW3), 6-ти (I-BW6) и 9-ти (I -BW9) ден, докато контролната група (I) е заразена с N. ceranae, но не е лекувана. Различните букви означават значителни разлики между групите.

Експресия на гени през времето в същата група

Според резултатите от теста на Kruskal-Wallis, нивата на генна експресия във всички групи се различават между дните за вземане на проби (дни 3, 6 и 12 pi), при което разликите са много близки до критичното ниво за значимост, но само няколко (Фиг. 5) са били значими (p-тия ден pi в сравнение с тези, събрани на 3-ти (z = 2.611; p = 0.009) и 12-ия ден pi (z = 2.611; p = 0.009), и значително по-ниски на 3-ия ден, отколкото на 12-ия ден ден pi (z = -2,402; p = 0,016) (U-тест на Mann-Whitney). Нивата на експресия на гена на Apidaecin в групата I-BW1 и I-BW3 са значително различни (H = 7,58; df = 2; p = 0,023 и H = 6,86; df = 2; p = 0,032 съответно) и бяха по-високи на 12-ия ден pi в сравнение с други дни за вземане на проби. Нивата на вителогенин в групата I-BW1 бяха значително различни (H = 10,14; df = 2; p = 0,006), което е значително по-ниско на 3-тия, отколкото на 6-ия и 12-ия ден по тест на Mann-Whitney U разкрива значителни разлики в експресията на гените на дефензин, вителогенин, апидецин и хименоптаецин между пчели, събрани на 3-ия и 12-ия ден в група I-BW3 в полза на 12-ти (Фигура 6).

Групата IBW-1 е заразена с спори на N. ceranae на 3-ти и е третирана с „BEEWELL AminoPlus“ от 1-ия ден след появата, докато контролата (I) е заразена с N. ceranae, но не е лекувана. Пчелите са взети проби за анализи на 3-ия, 6-ия и 12-ия ден след заразяването с N. ceranae. Различните букви означават значителни разлики между групите.

Групата IBW-3 е заразена с спори на N. ceranae на 3-ти и е третирана с „BEEWELL AminoPlus“ от 3-ия ден след появата. Пчелите са взети проби за анализи на 3-ия, 6-ия и 12-ия ден след заразяване с N. ceranae. Различните букви означават значителни разлики между времето за събиране.

В допълнение, различни стресори на медоносни пчели могат да повлияят на метилирането на ДНК и съответно на генната експресия [70]. Добре известно е, че дефицитът на някой от микроелементите (фолиева киселина, витамин В12, витамин В6, ниацин, витамин С, витамин Е, желязо или цинк) предизвиква увреждане на ДНК, причинявайки едно- и двуверижни разкъсвания, окислителни лезии, или и двете [71]. Освен това, храненето, богато на метил-донори, може да повлияе на метилирането на ДНК, което е замесено в социалната организация на пчелите [72] и вероятно в хуморалния, клетъчния и социалния имунитет. Храненето с добавка „BEEWELL AminoPlus“, съдържаща метилни донори (напр. Метионин и витамин В комплекс), може да предотврати ДНК хипометилирането. Освен това витамин С (като антиоксидант) в “BEEWELL AminoPlus” може да допринесе за предотвратяване на окислителни лезии на ДНК, вероятно причинени от паразит Nosema. Като се има предвид разликата в интензивността на инфекцията с Nosema и нивата на експресия на имунните гени, доказана в нашето проучване между допълваните с BEEWELL AminoPlus и контролните пчели, ние предполагаме, че хипометилирането на ДНК и оксидативният стрес могат да допринесат за имуносупресията. Необходими са по-нататъшни изследвания, както лабораторни, така и в кошера (за изследване на оксидативния стрес) и в полеви условия (за оценка на експресията на гените), за да се потвърди тази хипотеза.

Някои предишни резултати разкриват благоприятното въздействие на храненето върху здравето на пчелите, особено връзката между протеиновото хранене и имунитета, дълголетието, оцеляването на пчелите и тяхната защита срещу патогени [32–34,45,51]. Нашите резултати показват подобно въздействие върху здравето на пчелите, оказвано от „BEEWELL AminoPlus“. Използването му като имунопротективна добавка за заразени с нозема колонии е абсолютно препоръчително, тъй като лечението с фумагилин, макар и ефективно, би могло да бъде проблематично за здравето на пчелите, качеството на продуктите от кошерите и здравето на потребителите [73–75].

Това проучване демонстрира отрицателното въздействие на N. ceranae върху здравето на пчелите, както се съобщава по-рано [4,10,13–16,18,76,77]. Нашите резултати показват, че тестваната добавка „BEEWELL AminoPlus“ има потенциал да модифицира експресията на имунни гени в медоносните пчели, компрометирани от инфекция с N. ceranae. Добавката показа най-добра ефикасност, когато се прилага едновременно с инфекция с Nosema (група I-BW3), което предполага ранната пролет като най-подходящ период за приложението й, тъй като натоварването със спори на Nosema в кошера е най-високо през този период [76,78–80]. Независимо от това, за потвърждаване на тази хипотеза е необходимо допълнително тестване на ефектите на добавките в експеримент с кошери.