Jingjuan Hu

1 Държавна ключова лаборатория за изследване на органна недостатъчност, Ключова лаборатория по протеомика в провинция Гуангдонг, Катедра по патофизиология, Южен медицински университет, Гуанджоу, Китай

Хайхуа Луо

1 Държавна ключова лаборатория за изследване на органна недостатъчност, Ключова лаборатория по протеомика в провинция Гуангдонг, Катедра по патофизиология, Южен медицински университет, Гуанджоу, Китай

Йонг Дзян

1 Държавна ключова лаборатория за изследване на органна недостатъчност, Ключова лаборатория по протеомика в провинция Гуангдонг, Катедра по патофизиология, Южен медицински университет, Гуанджоу, Китай

Пън Чен

1 Държавна ключова лаборатория за изследване на органна недостатъчност, Ключова лаборатория по протеомика в провинция Гуангдонг, Катедра по патофизиология, Южен медицински университет, Гуанджоу, Китай

Резюме

Разпространението на безалкохолната мастна чернодробна болест бързо се увеличава в световен мащаб. Въпреки това, ефективните стратегии за борба с наднорменото тегло с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) са все още ограничени и резултатите остават лоши. В настоящото проучване ние оценихме комбинираните действия на диетичния капсаицин и антибиотици върху HFD-индуцирани физиологични аномалии при мишки. Мъжки мишки C57BL/6 бяха хранени с HFD (60% калории от мазнини) в продължение на 17 седмици и бяха изследвани резултантните патофизиологични ефекти. Лечението с антибиотици подчертано отслабва възпалението на червата и течовете, предизвикано от HFD, докато капсаицинът показва ограничени ефекти върху червата. Диетичният капсаицин обаче значително повишава експресията на PPAR-α в мастната тъкан, докато антибиотиците нямат такъв ефект. Животните, лекувани с комбинация от капсаицин и антибиотици, са имали най-малко наддаване на телесно тегло и индекс на мастна тъкан, както и най-ниско натрупване на чернодробна мазнина. Комбинираното лечение също максимално подобрява инсулиновата реакция, както показват тестовете за инсулинов толеранс. Тези резултати предполагат, че съвместното лечение с капсаицин и антибиотици, нова комбинация от стратегии, би действало синергично, за да смекчи индуцираното от HFD затлъстяване, затлъстяване на черния дроб и метаболитно разстройство.

ВЪВЕДЕНИЕ

Разпространението на безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD), предизвикано от дългосрочно натоварване на мазнини, се увеличава бързо в световен мащаб и се превърна в тежко здравословно и икономическо бреме [1–2]. Конвенционалните лечения за ограничаване на това заболяване не са успешни поради сложната му патогенеза [3]. Прогресията на HFD-индуцирана NAFLD включва взаимодействие с множество органи, от които червата и бялата мастна тъкан са двете основни цели [4–5]. HFD води до чревни аномалии като възпаление, дисбиоза и теч. Смята се, че тези ефекти се комбинират, за да причинят допълнително увреждане на черния дроб и мастната тъкан и насърчават затлъстяването и диабета [6–8]. Съобщава се, че изчерпването на чревната микробиота отслабва индуцираното от HFD затлъстяване и диабет [9-10]. От друга страна, състоянието на бялата мастна тъкан също играе важна роля за прогресията на затлъстяването [11]. Повишената експресия на ключови гени като PPARs насърчава покафеняването на бялата мастна тъкан и намалява аномалиите, причинени от HFD [12–13].

Капсаицинът, естественият активен компонент на люти чушки, има демонстриран ефект против затлъстяване. Последните доклади показват, че капсаицинът намалява наддаването на телесно тегло, натрупването на чернодробни липиди и инсулиновата резистентност, индуцирана от HFD [14–15]. Мастната тъкан може да бъде основната цел на капсаицин. Въз основа на горните наблюдения решихме да тестваме дали едновременното лечение с капсаицин и антибиотици ще покаже благоприятни ефекти както за червата, така и за мастната тъкан по време на HFD.

РЕЗУЛТАТИ

HFD промени TRPV1 експресия в перигонадната висцерална мастна тъкан

Съобщава се, че HFD намалява експресията на TRPV1 във висцералната мастна тъкан [16]. Изследвахме експресията на TRPV1, който служи като рецептор за капсаицин [17–18] в мастната тъкан, за да потвърдим тяхната асоциация. TRPV1 тРНК (Фигура (Фигура 1А) 1А) и нивата на протеин (Фигура (Фигура 1В) 1В) драстично намаляват след хронична HFD в перигонадната висцерална мастна тъкан. Нашите данни потвърдиха, че свързаният с капсаицин път може да повлияе на HFD аномалии.

антибиотиците

C57BL/6 мъжки мишки са били хранени с нормална диета чау (n = 6) или диета с високо съдържание на мазнини (n = 10) в продължение на 17 седмици. A. Установено е нивото на тРНК Trpv1 в перигонадната висцерална мастна тъкан. Б.. Имунохистохимичното оцветяване за TRPV1. Мащабна лента, 100 μm. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p (Фигура 2А). 2А). За по-нататъшно изследване на бактериалния състав в червата, ние извършихме 16S секвениране за ДНК от цекално съдържание. Както е показано на Фигура Фигура 2B, 2B, стойностите на алфа разнообразието, което е представено от PD цялото дърво, Шанън и Наблюдаваните видове, бяха увеличени след HFD в сравнение с NC. Освен това процентът на Actinobacteria, Bacteroidia и Verrucomicrobiae също е значително променен при HFD мишки (Фигура (Фигура 2C). 2C). Както непретегленият, така и претегленият анализ на основните компоненти (PCoA) разкриват, че NC и HFD клъстерите могат да бъдат напълно разделени (Фигура (Фигура 2D). 2D). Тези данни потвърждават, че HFD може да наруши чревната еубиоза.

C57BL/6 мъжки мишки са били хранени с нормална диета чау (n = 5) или диета с високо съдържание на мазнини (n = 7) в продължение на 17 седмици. A. общо бактериално натоварване в цекума; Б.. стойността на PD цялото дърво, Шанън и Наблюдавано видово разнообразие; ° С. процентът на посочения клас; д. анализът на PCoA. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p 3A-3B потвърждава, че капсаицинът може да повлияе на чревната микробиота, както се вижда от намалените Firmicutes, увеличените Bacteroidetes и нарушеното съотношение Firmicutes/Bacteroidetes в цекума на HFD и мишки, третирани с капсаицин, в сравнение с HFD мишки. За да тестваме дали променената микробиота, индуцирана от капсаицин, проявява физиологични ефекти, трансплантирахме изпражнения с мишки, хранени с HFD + Cap, в мишки, хранени с HFD, и проследявахме изменението на телесното тегло. Фигура Фигура 3C 3C показва, че изпражненията от мишки, хранени с HFD + CAP, не могат да намалят наддаването на телесно тегло, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини. Този резултат предполага, че въпреки че капсаицинът може да причини промяна на чревния микробен състав, такова изменение може да не показва физиологични функции.

C57BL/6 мъжки мишки са били хранени с нормална диета чау (n = 5) или диета с високо съдържание на мазнини (n = 5-9). A. относително изобилие на Firmicutes, Bacteroidetes и Б.. Съотношение твърдост/бактериоидети в сляпото черво; ° С. Повишаване на телесното тегло след 12 седмици HFD хранене. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p (Фигура 3А). 3А). Чревното възпаление, характеризиращо се с експресията на ключови цитокини/хемокини, като Tnfa, Ifng и Ccl4, е драстично намалено както в групите HFD + ABX, така и в HFD + Cap + ABX, докато капсаицинът не влияе върху експресията на тези възпалителни фактори (Фигура ( Фигура 4А). 4А). Освен това измерихме нивата на Tlrs (Tlr2, Tlr4), MAPK (p-38) и CD (Cd2 и Cd68), ключови молекули, участващи в възпалителния отговор. Tlr4 е значително намален при животни, хранени с HFD, лекувани с Cap + ABX, но не и при животни, лекувани само с антибиотици или капсаицин. Tlr2 и Cd68 показват тенденция към намаляване както при HFD + ABX, така и при HFD + Cap + ABX групи, но не и при HFD + Cap мишки. Само антибиотици или капсаицин намаляват експресията на Cd2 и p-p38, докато съвместното третиране допълнително намалява експресията на тези молекули (Фигура 4B-4D). Тези данни показват, че антибиотиците значително намаляват възпалението на червата, докато ползите от капсаицин са ограничени.

C57BL/6 мъжки мишки бяха разделени на 5 групи: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + капачка (n = 6); HFD + ABX + капачка (n = 6). A. Съдържание на фекален албумин; Б.. Ниво на Claudin2 протеин в илеума. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p Фигура 6A, 6A, Ppara, Pparg, Ppargc1a и Ppard показаха нарастваща тенденция в групата HFD + Cap в сравнение с HFD мишки. Само увеличението на нивото на PPARα иРНК достига статистическа значимост. Данните от имунохистохимията потвърждават резултата от генната експресия (Фигура (Фигура 6В). 6В). Cpt2 и Acadl, два PPARα целеви гена, показват значително по-висока експресия както при HFD + Cap, така и при HFD + Cap + ABX групи, отколкото при нелекувани мишки HFD, докато еднократното приложение на ABX не променя значително експресията на нито един от гените (Фигура (Фигура 6C)) 6С). Нашите резултати показват, че капсаицинът, но не и антибиотиците, драматично индуцира PPARα и свързаната експресия на целевия ген.

C57BL/6 мъжки мишки бяха разделени на 5 групи: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + капачка (n = 6); HFD + ABX + капачка (n = 6). A. Pparg, Pparα, Ppargc1a и Ppard ниво на иРНК в бялата мастна тъкан; Б.. PPARα имунохистохимично оцветяване; ° С. Ниво на иРНК на Cpt2 и Acadl. Мащабна лента, 50 μm. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p (Фигура 7А). 7А). Беше отбелязано, че преди лечението с антибиотици, няма разлика в увеличаването на телесното тегло между HFD и HFD + ABX мишки. Разликата се появи в отговор на приложението на антибиотици. Освен това мишките HFD + Cap + ABX показват най-ниското наддаване на телесно тегло сред всички групи. Индексът на епидидимална, подкожна, мезентериална и кафява мастна тъкан е значително намален при HFD + ABX, HFD + Cap и HFD + Cap + ABX в сравнение с нелекувани HFD мишки (Фигура (Фигура 7В). 7В). Забележително е, че HFD + Cap + ABX показват най-ниския индекс на епидидимална и подкожна мазнина; индексът на епидидимална мазнина е бил значително по-нисък при HFD + Cap + ABX, отколкото при HFD + ABX мишки. Оцветяването с хематоксилин и еозин (HE) за епидидимална мастна тъкан потвърждава горните констатации (Фигура (Фигура 7C). 7C). Нашите данни ясно показват капсаицин и антибиотици, синергично намалено затлъстяване, индуцирано от HFD.

C57BL/6 мъжки мишки бяха разделени на 5 групи: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + капачка (n = 6); HFD + ABX + капачка (n = 6). A. Увеличаване на телесното тегло; Б.. Индексът на епидидимална (Epi), подкожна (Sub), мезентериална (Mes) бяла мастна и кафява мастна тъкан (BAT); ° С. HE оцветяване на епидидимална бяла мастна тъкан. Мащабна лента, 100 μm. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p # p $ p & p (Фигура 8А). 8А). Въпреки това, антибиотиците, както и капсаицинът, значително намаляват натрупването на триглицериди в черния дроб. Нивото на холестерола не се променя драстично само от антибиотици или капсаицин. Интересното е, че черният дроб от HFD + Cap + ABX показва най-ниските нива на триглицериди и холестерол от всички групи (Фигура (Фигура 8B). 8B). Масленочервеното оцветяване в черния дроб потвърждава данните за чернодробните триглицериди (Фигура (Фигура 8C). 8C). Тези резултати показват, че едновременното лечение с капсаицин и антибиотици може максимално да подобри причинения от HFD мастен черен дроб.

C57BL/6 мъжки мишки бяха разделени на 5 групи: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + капачка (n = 6); HFD + ABX + капачка (n = 6). A. Плазмен триглицерид и ниво на холестерол; Б.. Чернодробни триглицериди и ниво на холестерол; ° С. Маслено червено O оцветяване на черния дроб. Мащабна лента, 100 μm. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p (Фигура 9А). 9А). В съответствие с това, нелекуваните HFD мишки проявяват най-лоша реакция на инсулин от всички групи (Фигура (Фигура 9В). 9В). Забележително е, че мишките, лекувани както с антибиотици, така и с капсаицин, показват най-голяма реакция на инсулин сред всички групи. Инсулиновата резистентност се характеризира с неуспех на инсулина да потисне експресията на глюконеогенни гени, което е основно медиирано от Akt сигналния път [26]. съотношението p-Akt/Akt в перигонадната висцерална мастна тъкан е по-високо при HFD + Cap + ABX мишки в сравнение с HFD мишки (Фигура (Фигура 9C). 9C). Тези данни показват, че едновременното приложение на антибиотици и капсаицин води до най-добро подобрение на индуцирана от HFD инсулинова резистентност.

C57BL/6 мъжки мишки бяха разделени на 5 групи: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + капачка (n = 6); HFD + ABX + капачка (n = 6). A. GTT (интраперитонеално) и площта под кривата (AUC) на всяка група; Б.. ITT (интраперитонеално) и площта под кривата (AUC) на всяка група. ° С. p-Akt, нива на Akt протеин в перигонадната висцерална мастна тъкан. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p # p $ p # p + p st седмица. GTT и ITT се извършват 2-3 седмици преди жертвата. За експеримент с GTT, мишките са гладували в продължение на 16 часа и 1 g/kg глюкоза се прилага i.p. Концентрацията на кръвната глюкоза се измерва при 0min, 30min, 60min, 90min и 120min. За експеримент с ITT, мишките са гладували в продължение на 6 часа и се прилага 0,35 U/kg инсулин i.p. Концентрацията на кръвната глюкоза се измерва при 0min, 30min, 60min, 90min и 120min. Всички мишки са имали свободен достъп до храна и вода и са били държани в контролирана от температурата колония в 12: 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Всички експериментални процедури бяха в съответствие с насоките на Националните здравни институти и бяха одобрени от местния комитет за грижа и употреба на животните на Южния медицински университет.

Анализ на микроби

Съдържанието на цекума се ресуспендира в PBS, съдържащ 0,5% Tween 20 и допълнително се подлага на цикъл -80 ° C/60 ° C три пъти, за да се разруши мембраната. Екстракцията на ДНК и общото натоварване на цекалните бактерии бяха допълнително анализирани, както е описано [45]. Количествената PCR в реално време беше извършена с използване на 16s rRNA праймери: 5′- GTGSTGCAYGGYTGTCGTCA-3 ′; 5′- ACGTCRTCCMCACCTTCCTC-3 ′; Фиксира грундове: 5′-GGAGYATGTGGTTTAATTCGA -3 ′; 5′-AGCTGACGACAACCATGCAC-3 ′; Bacteroidetes праймери: 5′-GGCGACCGGCGCACGGG -3 ′; 5′-GRCCTTCCTCTCAGAACCC-3 ′. Извършен е анализ на микробното разнообразие [46]. Накратко, първо усилвахме 16S рРНК гена V4 регион чрез PCR и използвайки платформата за секвениране Ion Torrent за по-нататъшно секвениране. Суровите последователности бяха контролирани с качество, използвайки QIIME (1.9.1). След това последователностите бяха демултиплексирани и групирани в оперативни таксономични единици (OTU) на видово ниво (97% сходство). И накрая, анализ на състава на щама, анализ на алфа разнообразието и анализ на бета разнообразие също бяха извършени от QIIME. LEfSe (LDA Effect Size, http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) е използван за определяне на дискриминационно такси.

PCR в реално време

Общата РНК се извлича с използване на Trizol съгласно инструкциите на производителя. Реакция на обратна транскрипция беше проведена чрез обратна транскриптаза (TOYOBO) в съответствие с инструкциите на производителя. PCR реакцията в реално време се провежда на ABI 7500 PCR система в реално време с cDNA проба, съдържаща 1 × SYBR Green PCR master mix (TOYOBO), като се използват праймерни последователности, получени от NIH qPrimerDepot. Относителният израз в сравнение с 18s рРНК се изчислява чрез сравнителния CT метод.

Хистологичен анализ

Тъканите бяха събрани и фиксирани в 10% буфериран формалин. След това пробата беше вградена в парафин и нарязана на участъци с дебелина 5 μm. Оцветяването с хематоксилин и еозин (HE) се извършва и анализира чрез микроскопия. Проведена е имунохистохимия с използване на първичните антитела за PPARα и TRPV1 (Proteintech). За замразени секции (8 μm) са използвани за оцветяване с Oil Red O.

Протеинов анализ и биохимичен анализ

Тъканният протеин се екстрахира с помощта на търговски лизисен буфер (KeyGene). Уестърн блот се извършва с използване на първичните антитела за Claudin-2 (Invitrogen), p-p38, (Bioworld technology), p-AKT, AKT (ABcolonal), β-Actin (Proteintech). Фекалният албумин се определя чрез ELISA (Bethyl Labs). Концентрациите на триглицериди и холестерол се измерват на автоматичния биомедицински анализатор (Roche) с помощта на търговски комплект.

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. За анализ на данните за капсаицин и антибиотици е използван двупосочен ANOVA анализ, последван от post hoc с двустранни t-тестове. За да се анализира променлива разлика между NC мишки и HFD мишки, беше използван 2-опашен несдвоен студент t тест. Стойността на р, по-малка от 0,05, се счита за статистически значима.

Бележки под линия

КОНФЛИКТИ НА ИНТЕРЕСИ

Авторите не декларират конфликт на интереси.

ФИНАНСОВА ПОДКРЕПА

Това проучване бе подкрепено отчасти от Startup Foundation for Advanced Talents на Южния медицински университет, Националната научна фондация на Китай (безвъзмездна помощ 31500952) и Фонда за природни науки за отличен млад стипендиант от провинция Гуангдонг (2016A030306043) към PC.