1 Катедра по микробиология, Институт по имунология и имунологични заболявания, Мозъчна Корея 21 PLUS Проект за медицински науки, Университетски колеж Йонсей, Сеул 120-752, Република Корея

ниската

2 Катедра по физика, Университет Йонсей, Сеул 120-752, Република Корея

Резюме

LDL играе важна роля в образуването на атеросклеротична плака и диференциацията на макрофагите. Няма обаче доклад относно степента на окисление на LDL и диференциацията на макрофагите. Нашето проучване показа, че диференциацията в M1 или M2 макрофаги е свързана с нивото на липидно окисление на LDL. Въз основа на нивото на липидна пероксидация, LDL се класифицира на LDL с високо окисление (hi-oxLDL) и LDL с ниско съдържание на окисление (LDL с ниско съдържание на оксид). Профилите на диференциация на макрофагите се определят чрез експресия на повърхностни рецептори и профили на секреция на цитокини. Индуцирана CD86 експресия и производство на TNF с ниско съдържание на оксид LDL-α и IL-12p40 в THP-1 клетки, показващи M1 макрофаги фенотип. Hi-oxLDL индуцирана експресия на манозен рецептор и производство на IL-6 и моноцитен хемоаттрактант протеин-1, които най-вече съответстват на фенотипа на М2 макрофагите. Допълнително подкрепящо доказателство за M2 поляризация от hi-oxLDL е индукцията на LOX-1 в THP-1 клетки, третирани с hi-oxLDL, но не и с ниско-oxLDL. Подобни резултати са получени при първични човешки моноцити. Следователно, нашите резултати категорично предполагат, че степента на окисление на LDL влияе върху диференциацията на моноцитите в M1 или M2 макрофаги и определя възпалителната съдба в ранните стадии на атеросклероза.

1. Въведение

Окисленият липопротеин с ниска плътност (oxLDL) играе критична роля в образуването на атеросклеротична плака, което се предизвиква от устойчивостта на натоварените с липиди макрофаги [1], както и от преченето на подвижността на ендотелните клетки [2] в артериалната стена. Диференциацията на моноцитите в макрофаги, които натрупват oxLDL, за да образуват пенообразни клетки, се индуцира от oxLDL [1, 3]. Процесът започва с ендотелна активация в субендотелните области чрез отлагане на oxLDL [4, 5]. Моноцитите мигрират в интимата, ръководени от хемокини [6] и се диференцират в макрофаги. След това тези макрофаги поглъщат модифицирани липопротеини и, докато натрупват излишни липиди, образуват пянасти клетки [3]. Клетките с пяна умират и отделят вътреклетъчно съдържание [7], което предизвиква възпалителна реакция. Това от своя страна привлича повече макрофаги в лезията. По време на този процес LDL може да се окисли от ензими, например миелопероксидаза [8, 9] или от реактивни кислородни видове (ROS) [3] във възпалителната микросреда на плаката. Въпреки че oxLDL е важен за атеросклеротичното възпаление, няма съобщения за степента на окисление на LDL и диференциацията на макрофагите.

Макрофагите имат основен принос за развитието и прогресирането на атеросклерозата. Моноцитите, които се набират в интимата, са изложени на различни стимули, като цитокини, липиди, желязо и калций, които съществуват в сложни микросреди. Тези фактори могат да повлияят на фенотипната поляризация на макрофагите и последващото им активиране [10]. Класически активираните (М1) макрофаги и алтернативно активираните (М2) макрофаги са добре дефинирани фенотипове. В допълнение, неотдавнашни проучвания предполагат, че при атеросклеротични лезии съществуват няколко подтипа на М2 макрофаги (M2a, b, c и d) и стимулирани субпопулации като Mox, Mhem, M (Hb) и M4 макрофаги [11].

Следователно, ние предположихме, че LDL с различни нива на окисление съществува в ранната атеросклеротична среда и че степента на окисление на LDL влияе на диференциацията на макрофагите в класически активирани (M1) или алтернативно активирани (M2) макрофаги, което определя възпалителната съдба за атеросклеротичното развитие. В това проучване моноцитите са третирани с високооксидиран LDL (hi-oxLDL) или нискооксидиран LDL (ниско-oxLDL) и тяхната повърхностна рецепторна експресия и профили на секреция на цитокини са анализирани, за да се определи дали се диференцират в M1 или M2 макрофаги.

2. Материали и методи

2.1. Реактиви

Човешкият естествен LDL и окисленият LDL са закупени от Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, MA, САЩ). По време на електрофорезата нискооксидният LDL мигрира по-далеч от естествения LDL и също се определя от ниска стойност на TBAR (8,7–11,8 nmol/mg протеин). Hi-oxLDL мигрира 2,7 пъти по-далеч от естествения LDL и се определя от висока стойност на TBAR (55,7–75,6 nmol/mg протеин). Анти-човешки CD86-PE и анти-човешки CD206- (рецептор на маноза) FITC антитела са закупени съответно от Beckman Coulter Inc. (Brea, CA, USA) и BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Анти-LOX-1 и анти-тубулиновите антитела са закупени съответно от Abcam (Cambridge, MA, USA) и BioLegend (San Diego, CA, USA). Рекомбинантен човешки M-CSF е закупен от BioLegend (Сан Диего, Калифорния, САЩ). LPS (Е. coli O26: B6) е закупен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).

2.2. Култура на клетки THP-1

Човешката моноцитна THP-1 клетъчна линия е закупена от ATCC и култивирана в среда RPMI1640, съдържаща 10% FBS и пеницилин-стрептомицин (100 единици/мл и 100 μg/mL, респ.) при 37 ° C в овлажнен 5% CO2 инкубатор.

2.3. Анализ на клетъчната пролиферация

Скоростта на клетъчна пролиферация беше измерена с помощта на колориметричния комплект за броене на клетки-8 (CCK-8) (Dojindo laboratories, Kyoto, Japan). THP-1 клетки се култивират при 1 × 105 клетки на гнездо в 24-гнездни плаки и се третират с естествен LDL, нисък оксид LDL или hi-oxLDL (50 μg/mL всеки). След 24, 48 или 96 часа, CCK-8 реагентът се добавя към всяка ямка и клетките се инкубират за 30 минути при 37 ° С. Супернатантата беше събрана и прехвърлена в 96-ямкови плаки. O.D. при 450 nm се определя със спектрофотометър.

2.4. Поточна цитометрия

THP-1 клетки се култивират при 2 × 10 5 клетки на гнездо в 12-ямкови плаки и се третират с естествен LDL, нисък оксид LDL или hi-oxLDL (50 μg/mL всеки). След 24 или 96 часа клетките се събират и анализират с помощта на поточна цитометрия за измерване на гранулираност и автофлуоресценция. За да се открият повърхностни маркери, клетките бяха третирани с естествен LDL, ниско съдържание на оксид LDL или hi-oxLDL (50 μg/mL всеки) в продължение на 96 часа и оцветени с РЕ-конюгирани анти-човешки CD86 антитела. Проточен цитометричен анализ беше извършен с поточен цитометър BD LSR II (BD Bioscience).

2.5. Конфокална микроскопия

THP-1 клетките се култивират в 2-ямкови камерни покривни стъкла при 2 × 10 5 клетки на кладенче и се третират с естествен LDL, LDL с ниско съдържание на оксид LDL или Hi-oxLDL (50 μg/mL всеки) за 96 часа. Прикрепените клетки бяха оцветени с конюгирани с FITC антитела срещу човешки манозен рецептор (CD206) и анализирани с помощта на микроскоп FV1000 (Olympus, Tokyo, Japan).

2.6. Изолиране на човешки моноцити и наблюдение на морфологичните промени

Кръв е получена от здрави донори след получаване на одобрение от вътрешния комитет за преглед и информирано съгласие (номер 4-2012-0088). Мононуклеарните клетки от периферна кръв (PBMC) се разделят чрез центрофугиране с градиент на плътност Ficoll-Hypaque (плътност = 1.077) при 1600 об/мин за 30 минути и човешките моноцити се пречистват от PBMCs, като се използва Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Bergsch Gladbach, Германия). Оцветяването за CD14 се извършва за потвърдена популация от моноцити и обикновено> 95% от клетките са положителни. Човешки моноцити са култивирани в среда RPMI1640, съдържаща 10% FBS и пеницилин-стрептомицин (100 единици/мл и 100 μg/mL, респ.) при 37 ° C в овлажнен 5% CO2 инкубатор. Човешки моноцити се култивират в 12-ямкови плаки при 2 × 105 клетки на гнездо и се инкубират както с M-CSF (50 ng/ml), така и с hi-oxLDL или с ниско съдържание на оксид LDL (50 μg/mL всеки) за 7 дни. Морфологични промени са наблюдавани с помощта на микроскоп с ярко поле (IX71, Olympus, Tokyo, Japan).

2.7. Имуносорбентен анализ, свързан с ензими (ELISA)

THP-1 клетки се култивират при 2 × 10 5 клетки на гнездо в 12 ямкови плаки и предварително се обработват с естествен LDL, LDL с ниско съдържание на оксид LDL или Hi-oxLDL (50 μg/mL всеки) за 24, 48 или 96 часа. Средата беше заместена с прясна среда и след това клетките бяха стимулирани с LPS (100 ng/mL). Първичните моноцити се култивират при 2 × 10 5 клетки на гнездо в 12-ямкови плаки и предварително се обработват както с M-CSF (50 ng/mL), така и с естествен LDL, LDL с ниско съдържание на оксид или LDL μg/mL всеки) за 24, 48 или 72 часа. Първичните моноцити се стимулират с LPS (20 ng/mL). Осемнадесет часа след стимулация с LPS се събират супернатанти за култура и се съхраняват при -80 ° C. ELISA се извършва с човешки цитокин TNF-

, Комплект за анализ на IL-12p40, IL-6 и моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) (BD Bioscience). O.D. при 450 nm беше определено.

2.8. Западно петно

THP-1 клетки се посяват при 2 × 105 клетки на ямка и се третират с естествен LDL, нисък оксид LDL или hi-oxLDL (50 μg/mL всеки). След 24 и 48 часа клетките се събират и лизират с лизисен буфер. След центрофугиране общият протеин се съхранява при -80 ° C. Всеки 50 μg протеинови проби се зареждат в 12% SDS-PAGE и се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана (GE Healthcare, NJ, САЩ). След това мембраните реагираха с анти-LOX-1 или анти-тубулинови антитела. Протеинови ленти бяха открити с помощта на West Save Up уестърн блот детекционен комплект (Ab frontier, Сеул, Корея).

2.9. Статистически анализ

Проведен е еднопосочен ANOVA анализ.

се счита за значимо.

3. Резултати

3.1. Диференциални ефекти на степента на LDL окисление върху индуцирането на гранулираност и пролиферацията на моноцити

За да се изследват ефектите от степента на LDL окисление, ние оценихме диференциацията и пролиферацията на THP-1 клетки след третиране с естествен LDL, нисък oxLDL или hi-oxLDL. Клетъчната гранулираност (Фигура 1 (а)) и автофлуоресценцията (Фигура 1 (б)) са значително увеличени в клетките, третирани с hi-oxLDL в сравнение с клетките, третирани с естествен LDL или нисък oxLDL. Тези ефекти от hi-oxLDL се увеличават с течение на времето. След лечение с hi-oxLDL, скоростта на клетъчна пролиферация не се променя в сравнение с тази на клетките, третирани с естествен LDL. Въпреки това, клетъчната пролиферация беше значително намалена в клетките, третирани с ниско съдържание на оксид LDL в сравнение с това в клетките, третирани с hi-oxLDL (Фигура 1 (в)). Тези резултати показват, че hi-oxLDL увеличава гранулирането и автофлуоресценцията, докато ниското съдържание на LDL намалява клетъчната пролиферация, което предполага, че моноцитите реагират по различен начин на степента на окисление на LDL.

3.2. Ефект на OxLDL върху експресията на повърхностни маркери на макрофаги

След това тествахме дали степента на LDL окисление влияе върху диференциацията на моноцитите в макрофаги. Когато клетките бяха третирани с ниско-oxLDL, нивото на експресия на маркера за M1 макрофаги, CD86, беше увеличено в сравнение с това в клетките, третирани с hi-oxLDL (Фигура 2 (а)). За разлика от това, нивото на експресия на маркера за М2 макрофаги, рецептор на маноза (CD206), е значително увеличено в клетките, третирани с hi-oxLDL, в сравнение с това в клетките, третирани с естествен LDL или нисък oxLDL (Фигура 2 (b)). Тези резултати показват, че степента на LDL окисление влияе върху диференциацията на моноцитите в различни подтипове на макрофагите.

3.3. Ефект на OxLDL върху производството на цитокини

За да се оцени производството на цитокини, THP-1 клетките бяха предварително изложени на диференциално окислен LDL за 24, 48 или 96 часа и след това се стимулираха с LPS. Производството на TNF- и IL-12p40 е намалено в клетките, предварително обработени с hi-oxLDL в сравнение с тези в клетките, предварително обработени с ниско съдържание на oxLDL (Фигура 3 (а)). Въпреки това, производството на IL-6 и MCP-1 е значително увеличено в клетките, предварително обработени с hi-oxLDL в сравнение с клетките, предварително обработени с ниско съдържание на oxLDL (Фигура 3 (b)). Тези резултати предполагат, че макрофагите отделят различни набори от цитокини в зависимост от нивото на окисление на LDL. По-интересното е, че ниското съдържание на LDL и Hi-oxLDL индуцират противоположни цитокинови профили.

, IL-12p40, IL-6 и MCP-1 бяха измерени чрез ELISA. Данните представляват означава ± S.E. от три независими експеримента. За определяне на значимостта е използван еднопосочен ANOVA анализ (

3.4. Ефекти на OxLDL върху експресията на LOX-1

OxLDL се свързва с рецептори за отстраняване, като LOX-1, и също така индуцира експресията на LOX-1 в макрофагите. Тествахме ефекта на oxLDL върху експресията на LOX-1 в THP-1 клетки. Експресията на LOX-1 се увеличава в клетките, третирани с hi-oxLDL в сравнение с клетките, третирани с естествен LDL или нисък oxLDL след 24 или 48 часа (Фигура 4). Експресията на LOX-1 беше леко, но не значително намалена в клетки, третирани с LDL с ниско съдържание на оксид, в сравнение с тази в клетки, третирани с естествен LDL (Фигура 4).


3.5. Ефекти на OxLDL върху морфологичните промени и производството на цитокини в първични моноцити

Когато човешките моноцити се третират с ниско съдържание на оксид LDL, клетките се променят във вретеновидна форма, което е уникална характеристика на M1 макрофагите, докато лечението на hi-oxLDL води до кръгли клетки, които представляват M2 макрофаги (Фигура 5 (а)) . Производството на TNF-α и IL-12p40 е намален в моноцити, предварително обработени с hi-oxLDL в сравнение с клетки, предварително обработени с ниско-oxLDL (Фигура 5 (b)). Освен това, производството на IL-6 и MCP-1 е значително увеличено в моноцити, предварително обработени с hi-oxLDL (Фигура 5 (в)). Тези резултати потвърждават, че степента на окисление на LDL засяга първичните моноцити по подобен начин на моноцитната клетъчна линия, THP-1 клетки.

4. Дискусия

По време на развитието на атеросклеротична плака, LDL може да се окисли в различна степен от ROS или ензими, освободени от макрофаги в субендотелната област [3]. Този модифициран LDL, заедно с растежни фактори като M-CSF, влияе върху диференциацията на моноцитите в макрофаги. В зависимост от степента и продължителността на окислението, физикохимичните свойства на LDL, като заряд, размер на частиците и съдържание на липиди, се променят [12]. Освен това, в зависимост от това дали липидният или протеиновият компонент е окислен, окисленият LDL може да индуцира различни сигнални пътища [13]. Нашето проучване изследва ефектите на диференциално окисления LDL върху диференциацията на макрофагите. Използвахме два вида oxLDL, които бяха класифицирани като ниско-oxLDL или hi-oxLDL въз основа на стойността на TBAR за липидна пероксидация и относителна електрофоретична подвижност на LDL частици върху агарозни гелове [14, 15].

MCP-1 играе важна роля при набирането на циркулиращи моноцити до възпалени места. MCP-1-медиираното набиране на моноцити допринася за патогенезата, но няколко проучвания показват, че MCP-1 има благоприятна роля при различни възпалителни състояния. В червата макрофагите на lamina propria, които разкриват М2-подобен фенотип, произвеждат големи количества MCP-1. Освен това, подгрупа от макрофаги на lamina propria се набира в отговор на MCP-1 и произвежда голямо количество IL-10, за да поддържа хомеостазата на червата в стабилно състояние, както и да прекрати излишното възпаление в червата [23]. Освен това MCP-1 оказва благоприятен ефект при други възпалителни заболявания като исхемични сърдечни заболявания чрез инхибиране на генерирането на ROS и чрез заздравяване на некротични области в миокарда [24, 25].

Точните роли на IL-6 и MCP-1 все още са спорни. Предишни проучвания за противовъзпалителните ефекти на IL-6 и MCP-1 подкрепят нашите резултати, че индуцирана от hi-oxLDL диференциация на макрофагите се отклонява към M2-подобния фенотип, а не към M1 фенотипа (Фигури 2 (b) и 3 (б)).

Нашите резултати показват, че hi-oxLDL индуцира производството на IL-6 и MCP-1 в макрофаги, което показва, че експресията на тези цитокини може да е характеристика на M2 макрофагите. Въпреки че интерпретацията на цитокиновите профили може да бъде трудна, повечето от нашите резултати за производството на цитокини и експресията на повърхностни маркери предполагат, че ниско съдържание на оксид LDL индуцира поляризация на M1, докато hi-oxLDL води до поляризация на M2.

След това оценихме експресията на LOX-1. LOX-1 е рецептор за oxLDL и се експресира в различни клетки, като ендотелни клетки, мускулни клетки, моноцити и макрофаги [2, 26, 27]. След свързване с oxLDL, LOX-1 се интернализира; това индуцира ендоплазмен ретикулум (ER) стрес, който причинява повишено регулиране на LOX-1, което се случва чрез положителна обратна връзка между ER стрес и експресия на LOX-1 и диференциация на макрофагите в M2 макрофаги заедно с образуването на пяна клетки [27–29]. Фигура 4 показва, че лечението с hi-oxLDL повишава експресията на LOX-1 на макрофагите. Тези високи нива на LOX-1 усилват сигналите от hi-oxLDL и по този начин предизвикват повишена диференциация в М2 макрофаги. Доклад, използващ мезенхимни стволови клетки, демонстрира, че лечението с oxLDL значително увеличава експресията на LOX-1 и MCP-1 [30], но в която степента на окисление на LDL не е ясно определена.

И накрая, ние изследвахме ефектите на диференциално окисления LDL в първичните моноцити. Нашето проучване показа, че първичните моноцити са се променили във формата на вретено след лечение с ниско съдържание на оксид LDL и в кръгли клетки след лечение с hi-oxLDL. Добре известно е, че формата на M1 макрофагите приема по-скоро вретеновидна форма, докато M2 макрофагите са по-заоблени [31, 32]. В допълнение към морфологичните промени, профилите на цитокините и намаленото производство на TNF-α и IL-12p40, както и увеличеното производство на IL-6 и MCP-1 след третиране с hi-oxLDL (Фигура 5 (b)) силно подкрепят ролята на диференциално окисления LDL в диференциацията на моноцитите към M1 или M2 макрофаги.

Взети заедно, нашите резултати за гранулираност, автофлуоресценция, цитокинови профили и производители на повърхността предполагат, че ниското съдържание на оксид LDL индуцира поляризация на макрофагите към фенотип M1, докато hi-oxLDL индуцира фенотип M2. Както е обобщено на Фигура 6, нашите резултати показват, че степента на окисление на LDL е важният фактор за диференциацията на моноцити и макрофаги и може да определи състоянието на възпаление или дори развитието на атеросклероза в ранните стадии на заболяването.