Наотака Сакамото 1, Едмонт Стоянов 2 *

Информация за автора и статията

Цитирайте това като

Sakamoto N, Stoyanov E (2020) Диференциален анализ на O- (2-хидроксипропил) целулоза чрез използване на двумерна 1 H-NMR спектроскопия. Biomed Sci Eng 6 (1): 010-015. DOI: 10.17352/abse.000015

Резюме

Двумерен 1H-NMR се използва за определяне на вътремолекулните взаимодействия на O- (2-хидроксипропил) целулоза (HPC) във водни (D2O), DMF и DMSO разтвори. Четири степени HPC с различни молекулни тегла се анализират чрез използване на NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) за протон-протонни кръстосани взаимодействия. Силната зависимост на структурата на полимерната верига от HPC молекулярното тегло (MW) е прекомерна. По-ниските MW HPC съществуват в решения като по-линейна верига, показваща по-малко протон-протонни взаимодействия, докато по-високите MW HPC са по-усукани и огънати и образуват заплетена молекулна бъркотия с много интензивни взаимодействия между протоните -CH3, -CH2- и -CH . От всички степени, свръхниско молекулното тегло HPC-UL (MW 20 000) разкри най-слабите протон-протонни кръстосани релаксации и съществува в разтвори, вероятно само като почти линейна полимерна верига.

Основен текст на статията

Въведение

Причината за много по-добрата функционалност на HPC с нисък mwt като разтворител за слабо разтворими лекарства все още не е добре изяснена и внимателният поглед върху структурата на HPC в разтвор може да даде отговор на този въпрос.

Химичната структура на хидроксипропил целулозата вече е изследвана за 1 H и 13 C-NMR [8,9]. Kimura et al., [8], описва подробно степента на заместване (DS), молекулярно заместване (MS) и дори различната реактивност на хидроксилните групи в целулозната молекула въз основа на 13 C-NMR в D2O пикови интеграли. Използвайки същия метод за ЯМР въглерод, Desai et al., [9], обясняват различните показатели на HPC с различни облачни точки, като също така дават подробности за съотношението външен/единичен въглерод спрямо вътрешен въглерод. Тези фундаментални трудове приемат молекулярната структура на HPC като независима от молекулното тегло и че степента, изследвана в проучванията, се предполага, че е представителна за цялото семейство HPC молекулни тегла.

Въз основа на публикуваната информация не можем да обясним защо само HPC с ниско молекулно тегло работи като лекарствен разтворител. Не могат да бъдат открити съществени разлики във физико-химичните свойства (разтворимост, DS, MS и съотношение вътрешен/външен въглерод) между различните степени на този целулозен етер. За да получим по-добро разбиране за това явление, решихме да проучим какво се случва с разтворената HPC полимерна верига в пространството, като използваме специален двумерен 1 H-NMR анализ - Nuclear Oherhauser Effect (NOE). Стандартните 1 H-NMR спектри показват протонното спин-спиново свързване поради химични връзки, докато NOE се появява през пространството, когато разстоянието между два протона е по-малко от 4,9 Å. По този начин, използвайки NOESY (Спектроскопия с ефект на ядрен свръхаузер) можем да получим информация за атоми и групи, които са в непосредствена близост един до друг в една и съща молекула. Този ЯМР метод вече се използва успешно за изследване на триизмерни структури на много протеини и други макромолекули [10-14].

В настоящата работа ние описваме диференциален анализ на четири степени хидроксипропил целулоза с различни молекулни тегла (вискозитети) чрез използване на NOESY в DMSO-d6, DMF-d7 и D2O.

Експериментално

Химикали

Хидроксипропил целулоза (HPC) със средно молекулно тегло 140 000 (HPC-L), 100 000 (HPC-SL), 40 000 (HPC-SSL) и 20 000 (HPC-UL) са предоставени от Nippon Soda, Япония. Всички HPC степени имат сходни физико-химични характеристики като молекулярно заместване (MS), съдържание на хидроксипропокси (HPO) и съотношение външен метил + единичен метил към вътрешен метил [6] (външен/вътрешен) са избрани за измерванията (Таблица 1). Единствената подходяща разлика е в молекулярното тегло (MW).

Маса 1: Физико-химични характеристики на HPC.
HPC MWa ГОСПОЖИЦА. HPO (%) b Външен/Вътрешен
L 1,40 000 3.83 74.8 1.11
SL 1,00 000 3.62 73 1.13
SSL 40 000 3.67 73.4 1.1
UL 10 000 3.35 70.5 1.07
aGPC метод; средна стойност. bJP17 метод.

Деутерираният диметилсулфоксид (DMSO-d6, 99.9% D) и деутерираният диметилформамид (DMF-d7, 99.5% D) са закупени от FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Япония. Деутериевият оксид (D2O, 99,8% D) е закупен от Tokyo Chemical Industry, Япония.

приготвяне на пробата

За DMSO-d6 и DMF-d7, за да се избегне обменът на OH групи с остатъчна вода, пробите се приготвят, както следва: a. предварително претегленото количество HPC се суши при 45 ° С за една нощ, след което се поставя в ексикатор над CaCl2 за 30 минути под вакуум; б. след това пробата се разтваря в деутерирания разтворител (0,5%) при стайна температура под азотна атмосфера. За деутерирана вода (D2O), където остатъчният H2O не играе важна роля, подготовката на пробата включва претегляне и приготвяне на 0,5% разтвор.

Оборудване и условия на измерване

За измерванията е използван Bruker Biospin AVANCE III HD 500 Onebay: време на смесване 0,3s; брой сканирания 8. Като вътрешен стандарт се използва тетраметил силан (Me4Si).

Резултати и дискусия

Хидроксипропил целулозата е целулозен етер, който се състои от приблизително 25-30% целулоза и 70-75% полипропилен оксид (съдържание на HPO Таблица 1, Фигура 1).

2-хидроксипропил

Целулозната кост на полимерната верига е отговорна за известна твърдост и хидрофилност на молекулата, докато страничната полипропиленоксидна верига за известна хидрофобност и гъвкавост.

Възможните теоретични протон-протонни кръстосани релаксации в HPC разтвори са обобщени на Фигура 2.

В зависимост от линейността на веригата и нейното положение в пространството, интензивността на взаимодействията може да варира.

1 H-NMR за HPC-L, SL, SSL и UL

Химичните измествания на 1 H-NMR спектрите за всички HPC степени, измерени в DMSO-d6, DMF-d7 и D2O, са дадени в таблица 2.

Таблица 2: 1 H-NMR спектри от всички степени HPC.
Разтворител δ в ppm
СН3 ° СЗ.2, СЗ. З. С1 ОХ
DMSO-d6 1,02, s 3,05-3,89, m 4.39, бр. с. 4.22, 4.42, br. с.
DMF-d7 1,07, s 3,05-3,88, m 4,56, бр. с. 4.32, 4.56, br. с
D2O 1,18, s 3,24-3,98, m 4,53, бр. с. не се наблюдава

Първо, измерихме 1H-NMRs в деутерирани органични разтворители, които нямат сменяеми протони: диметилсулфоксид (DMSO) и диметилформамид (DMF), където O-H протоните не могат да се обменят и показват собствен пик в спектъра. Пробите бяха предварително изсушени, за да се избегне обмен на O-H с остатъчната вода. Фигура 3 показва 1 H-NMR спектъра на HPC-L в DMSO-d6 (като пример) с пиковете на различните протони.

Метиловите групи се появяват като синглети при 1,02 ppm, докато метиленовите групи (-O-CH2-; -O-CH (CH3) -CH2-O-, cel-CH2-O-), вътрешни и външни алфа-протони (CH3- CH, HO-CH (CH3) -CH2-) и целулозните протони (cel-H от C2, C3 и C4) са с ниско поле, изместени като мултиплет при 3.05-3.89ppm. За това изследване не беше необходимо да се прави разлика между протоните на третичните и вторичните въглероди в този мултиплет, тъй като тяхното взаимодействие с протоните на другите функционални групи е идентично. C1 целулозните протони се появяват като широк синглет при 4.39 ppm. Хидроксилните протони, сменяеми с D2O, се появяват като два широки синглета: един по-силен при 4.42ppm и един по-слаб при 4.22ppm. За да се определи точното положение на хидроксилните протони, към разтвора на пробата се добавя деутерирана вода (D2O). След добавянето на D2O, пиковете при 4.22 и 4.42ppm изчезнаха, докато пикът за C1 протон остана непроменен при 4.39ppm (Фигура 4).

Останалите HPC степени (SL, SSL и UL) имат идентични 1 H-NMRs с HPC-L както в DMSO-d6, така и в DMF-d7.

1H-NMR спектърът на HPC във воден разтвор изглежда малко по-различно в сравнение с тези в DMSO и DMF. Метиловите групи се появяват като остър синглет при 1,18 ppm. Метиленовите групи (-O-CH2-; -O-CH (CH3) -CH2-O-, cel-CH2-O-), вътрешни (CH3-CH) и външни (HO-CH (CH3) -CH2-) алфа-протоните, както и целулозните протони (cel-H от C2, C3 и C4), всички са с ниско поле, изместени като мултиплет при 3.24-3.98ppm. Целулозните протони C1 се появяват като широк синглет при 4,53 ppm. Хидроксилните протони не могат да се наблюдават поради обмен на H-D в разтвор с D2O. Фигура 5 показва 1 H-NMR на HPC-L като пример.

Всички останали HPC степени (SL, SSL и UL) имат идентични 1 H-NMRs с HPC-L.

NOESYs на HPC-L, SL, SSL и UL NOESYs в DMSO-d6

HPC с най-високо молекулно тегло (L) показва множество H-H взаимодействия между функционалните групи (Фигура 6). Най-силен беше този между протоните на СН, СН2 и СН3 групи (III и IV). Това взаимодействие беше много силно, докато независимо от това кой протон е източникът. Това говори за непосредствена близост на тези групи в пространството. Метилните протони демонстрират също взаимодействие с C1 протоните от целулозната част (II), както и с протоните на хидроксилните групи (I). Това говори за близко разстояние между вътрешната и външната пропоксилни групи и целулозния скелет.

Класовете HPC с по-ниско молекулно тегло разкриват същите взаимодействия, но с намален интензитет, пропорционално на намаляването на тяхното молекулно тегло (Фигура 7).

Като цяло интензивността на всички наблюдавани кръстосани релаксации (I-IV) намалява с намаляването на молекулното тегло на HPC. Най-голямата разлика се наблюдава в кръстосаните релаксации между хидроксилните и С1 целулозните протони и протоните на метиловата група. Можем да заключим, че разстоянието между крайните пропокси групи и целулозния скелет е по-голямо при HPC с по-ниско молекулно тегло. При HPC-UL (MW 10 000) кръстосаната релаксация беше с най-ниска интензивност, говорейки за почти линейна, не много огъната структура в разтвор на DMSO.

NOESYs в DMF-d7

1H-NMRs в DMF-d7 са почти идентични с тези в DMSO-d6. Наблюдават се различия в спектрите на NOE, където протон-протонните кръстосани релаксации в DMF са много по-силни (Фигура 8).

В DMF-разтворите HPC молекулата изглежда по-заплетена, отколкото в DMSO-разтворите. По този начин, в DMF, функционалните групи изглежда са в непосредствена близост в пространството и си взаимодействат по-силно в сравнение с DMSO. Това се потвърждава и от NOESYs от другите HPC степени (SL, SSL и UL). Както е показано на Фигура 9, също и в DMF, се наблюдава значително намаляване на H-H-кръстосаните релаксации чрез намаляване на HPC MW: HPC-UL (черно) срещу HPC-SL (червено).

NOESYs в D2O

В деутерираната вода (D2O) всички наблюдавани протон-протонни кръстосани релаксации обикновено са по-слаби в сравнение с DMSO и DMF (Фигура 10, пример HPC-L).

Както се очаква, протон-протонна кръстосана релаксация между протоните на хидроксилната и метиловата група (I) липсва поради обменния O-H протон. Интензивността на кръстосаните релаксации III и IV във водни разтвори са най-силните, както при DMSO и DMF, докато кръстосаната релаксация II (C1 целулозни протони и протони на метилова група) е по-слаба (Фигура 10). Очевидно във вода HPC молекулата е по-добре разтворена, напълно хидратирана и разтегната в сравнение с органичните разтворители (DMSO и DMF). Полимерната верига е отворена и дава по-малко заплетена структура. Освен това разстоянията между протоните на метиловата група и C1 целулозните протони (II) са по-големи във водните разтвори, отколкото в DMSO и DMF, което може да улесни взаимодействието с други малки молекули.

Подобно на органичните разтворители DMSO и DMF, във водния разтвор всички други HPC степени разкриват намаляване на протон-протонните кръстосани релаксации, пропорционално на намаляването на тяхното молекулно тегло/дължина на молекулата (Фигура 11).

Във всички използвани разтворители HPC-UL с ултраниско молекулно тегло разкри най-ниската интензивност на кръстосаната релаксация на протон-протон, потвърждавайки по-малко заплетена и огъната структура в разтвори в сравнение с другите, по-високи MW HPC степени (L, SL и SSL, Фигура 12).

Във водните разтвори, наблюдаваните разлики в интензивността на взаимодействията CH3-CH3 (протон-протонни кръстосани релаксации) при 1.1ppm, причинени от по-близката близост на тези функционални групи във воден разтвор, потвърждават наблюдаваните незначителни разлики в точката на облачност на различни HPC степени. По-силно взаимодействие CH3-CH3 с увеличаване на молекулното тегло на HPC съответства на намаляване на точката на облака (Фигура 13).

Заключения

NOESY анализ на HPC разтвори в органични разтворители (DMSO и DMF) и воден разтвор разкрива връзка между молекулното тегло (дължината на полимерната верига) и структурата: HPC с ниска MW показва по-линейна структура с ниско интензивно протонно-протонно кръстосано отпускане между функционалните групи протони. Водните HPC разтвори благоприятстват по-спокойна и по-малко заплетена полимерна верига с по-голямо пространство между функционалните групи. В органичните разтворители HPC веригата е по-заплетена и огъната с множество кръстосани релаксации. Разликите в точката на облачност на HPC, причинени от взаимодействията между метиловите групи в пространството, също са пропорционални на тяхното молекулно тегло. HPC-UL с ултра ниско молекулно тегло демонстрира най-ниската сила на молекулните взаимодействия поради по-линейната полимерна структура.

Подкрепата, предоставена от Съвета за научни и технологични изследвания на Турция (TUBITAK, проект №: 113Z181) и Техническия университет Карадениз, BAP, Турция (Реф. № 8623) е високо оценена.