Нов механизъм за дисфункция на β-клетките на панкреаса

  1. Мингминг Хао,
  2. У. Стивън Хед,
  3. Субхадра С. Гунавардана,
  4. Алиса Х. Прибързан и
  5. Дейвид У. Пистън
  1. От катедрата по молекулярна физиология и биофизика, Университетски медицински център Вандербилт, Нешвил, Тенеси
  1. Адресирайте кореспонденцията и заявките за повторно отпечатване до Дейвид У. Пиштън, Катедра по молекулярна физиология и биофизика, Университетски медицински център Вандербилт, 735 Light Hall, Нешвил, Тенеси 37232. E-mail: dave.pistonvanderbilt.edu

Нов механизъм за дисфункция на β-клетките на панкреаса

Резюме

ОБЕКТИВЕН—Диабетът тип 2 често се придружава от ненормални нива на липидите и липопротеините в кръвта, но повечето изследвания за връзката между хиперлипидемия и диабет са фокусирани върху свободните мастни киселини (FFA). В това проучване изследвахме връзката между холестерола и секрецията на инсулин от β-клетките на панкреаса, която е независима от ефектите на FFA.

секретиращ

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА- Използвани са няколко метода за модулиране на нивата на холестерола в непокътнати островчета и култивирани β-клетки, включително наскоро разработен модел на мишка, който показва повишен холестерол, но нормални нива на FFA. Острата и метаболитна промяна на холестерола се извършва с помощта на фармакологични реактиви.

РЕЗУЛТАТИ—Намерихме пряка връзка между повишения серумен холестерол и намалената секреция на инсулин, като нормалната секреция се възстановява чрез изчерпване на холестерола. Освен това ние демонстрираме, че излишъкът от холестерол инхибира секрецията чрез понижаване на метаболизма чрез повишена димеризация на невроналния азотен оксид синтаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ—Този пряк ефект на холестерола върху метаболизма на β-клетките отваря нов набор от механизми, които могат да допринесат за дисфункцията на β-клетките и появата на диабет при пациенти със затлъстяване.

  • 2-DG, 2-дезоксиглюкоза
  • апоЕ, аполипопротеин Е
  • FFA, свободна мастна киселина
  • GK, глюкокиназа
  • GSIS, стимулирана от глюкоза секреция на инсулин
  • MβCD, метил-β-циклодекстрин
  • nNOS, невронална азотно-оксидна синтаза

Холестеролът може да регулира трансдукцията на сигнала чрез мембранни микродомейни и генната експресия чрез активирани от холестерола транскрипционни фактори (6). Например, вътреклетъчният холестерол регулира метаболизма на глюкозата и генната експресия в адипоцитите (7). GSIS е сложен процес, включващ каскада от регулаторни фактори. Неправилното регулиране на холестерола може да доведе до нарушаване на всеки един път и да доведе до частична или почти пълна загуба на секреторна функция. Това проучване се фокусира върху функцията на богатите на холестерол мембранни микродомени в GSIS.

Плазмените мембрани на клетките на бозайници съдържат 30-50% моларна част от холестерола (8). Холестеролът се обогатява и във вътрешните мембрани (9). Холестеролът играе съществена роля в организацията, динамиката и функцията на мембраната. Смята се, че допринася за стегнатото опаковане на липиди, като запълва интерстициалните пространства между липидните молекули. Мембранните микродомени са малки мембранни възли, обогатени с холестерол и сфинголипиди и съжителстват с по-течни домени, обогатени с фосфолипиди с ненаситени въглеводородни вериги (10). Образуването на тези мембранни микродомени се наблюдава само в рамките на критични концентрации на холестерол (11). Добре известно е, че както течността на мембраната, така и кривината са силно модулирани от количеството холестерол, присъстващо в мембраната (12). Мембранните микродомени могат да подобрят клетъчната сигнализация чрез локално концентриране или изключване на избрани протеинови компоненти на определени места на мембраните. В това проучване ние изследваме GSIS в β-клетки, където свойствата на мембраната са променени чрез изчерпване или претоварване на холестерола.

Към днешна дата ограничените проучвания за участието на мембранни микродомени в GSIS от β-клетки на панкреаса са фокусирани само върху протеините в плазмената мембрана. Показано е, че изчерпването на холестерола води до преразпределение на K + канал KV2.1 и разтворими N-етилмалеимид-чувствителни към протеини рецепторни протеини на прикрепване на протеини от резистентни на детергент към разтворими домени в β-клетки и от своя страна подобрява GSIS (13,14). Мембранните микродомени също играят съществена роля в индуцираното от интерлевкин-1β освобождаване на азотен оксид (NO) от β-клетки (15). Нашите резултати в това проучване показват, че в допълнение към промените в протеините, присъстващи в плазмената мембрана, глюкозният метаболизъм, включващ глюкокиназа (GK), се влияе от промяната на холестерола. Тук показваме, че излишният клетъчен холестерол е пряко свързан с намаления GSIS и че нормалната секреция може да бъде възстановена чрез изчерпване на холестерола. Освен това демонстрираме един потенциален механизъм за регулиране на холестерола на GSIS, който включва модификация на невроналната NO синтаза (nNOS) и активността на GK чрез богати на холестерол мембранни микродомени върху инсулиновите гранули.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Мишки, клетки и островчета.

Използвани са мишки C57BL/6J (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN), освен ако не е посочено друго. Бяха закупени мишки с дефицит на Apolipoprotein E (apoE) (ApoE -/-) (B6.129P2-Apoe tm1Unc/J), съответстващи контролни мишки (C57BL/6J) и мишки с нокаут nNOS (B6.129S4-Nos1 tm1Plh/J) от лабораторията Джаксън (Bar Harbor, ME). ob/ob; апоЕ -/- мишки (на C57BL/6J фон) са произведени чрез кръстосване на мишки ob/+ и апоЕ -/- (16). Всички мишки бяха държани на гризач за гризачи (LabDiet 5001, 12% от калориите от мазнини) и се грижеха за тях в съответствие с насоките на Институционалния комитет за грижа и употреба на животните на Vanderbilt. 832/13 INS-1 клетки бяха любезен подарък от д-р Newgard (Duke University, Durham, NC). βTC3 и 832/13 INS-1 клетки на инсулинома бяха култивирани и подготвени за експерименти, както е описано по-горе (17,18). Панкреатичните островчета са изолирани и култивирани с помощта на методи, разработени в нашата лаборатория (19).

Анализ на холестерола в островчета.

Съдържанието на холестерол се определя количествено в 96-ямкова плака чрез флуорометричен метод, като се използва ензимно свързана реакция, предоставена от комплекта за анализ на червен холестерол на Amplex (Molecular Probes). След изолирането островчетата бяха разделени на две групи за анализ на холестерол и инсулин. За измерване на холестерола материалът от всяка епруветка, съдържаща 10 островчета, беше подложен на липидна екстракция с хлороформ/метанол (2: 1; обем/обем), изсушен до тънък филм и ресуспендиран в 60-μl 1 × работен разтвор (Amplex Red Комплект за анализ на холестерола), допълнен с 0,1% Triton X-100. От това се използват 50 μl за анализ на холестерола и 10 μl за анализ на протеини (BCA протеинов анализ; Pierce, Rockford, Il).

Измервания, стимулирани от глюкоза, секреция на инсулин.

Статичните инкубации на панкреатичните островчета за измерване на секрецията на инсулин бяха направени, както беше описано по-рано (19). Инсулиновите радиоимуноанализи бяха извършени от Центъра за изследване и обучение на диабета Hormone Core Resource в университета Вандербилт. Общият холестерол на мишки в серума, триглицеридите и свободните мастни киселини бяха измерени от Центъра за метаболитно фенотипиране на мишки Vanderbilt за липиди.

Манипулация на холестерола.

За изчерпване на метаболизма, островчета се отглеждат в продължение на 3 дни в среда за изчерпване на метаболизма (RPMI-1640; подобна на средата за растеж, но с 10% серум с дефицит на липопротеини вместо FBS, допълнен с 200 μmol/l мевалонат [необходим за поддържане на жизнеспособността на клетките ] и 10 μmol/l мевастатин) за блокиране на синтеза на холестерол и изчерпване на запасите от холестерол (20). За изчерпване с метил-β-циклодекстрин (MβCD) (Sigma), островчета и β-клетки се инкубират с 10 mmol/l MβCD при 37 ° C в продължение на 1 час, което премахва холестерола както от плазмената мембрана, така и от вътреклетъчните запаси, тъй като вътреклетъчният холестерол изтича ефективно към плазмената мембрана, където бързо се отстранява от MβCD като акцептор (9). За да се претовари с холестерол, клетките се инкубират с 10 mmol/l разтворим холестерол (Sigma; 1 g съдържа ~ 40 mg холестерол) при 37 ° C за 1 h.

Анализ на глюкокиназната активност.

Ензимната активност на GK се измерва чрез метод за непрекъснато определяне на спектрофотометрична скорост (21), като се използват 60 mmol/l Tris, 20 mmol/l MgCl, 2,5 mmol/l дитиотреитол, 100 mmol/l KCl, 4 mmol/l аденозин 5′-трифосфат, 0,9 mmol/l β-никотинамид аденин динуклеотид фосфат и 10 единици глюкоза 6-фосфат дехидрогеназа. Една единица активност на GK се определя като фосфорилиране на 1 μmol d -глюкоза до d -глюкоза 6-фосфат на минута при рН 9.0 при стайна температура. Активността на GK се измерва чрез изваждане на активността, измерена при 0,5 mmol/l глюкоза, от тази при 100 mmol/l глюкоза, за да се отчете активността на хексокиназата в клетъчните лизати.

Нискотемпературен SDS-PAGE.

Клетките бяха събрани в студен PBS и ресуспендирани в буфер за студен лизис (20 mmol/l HEPES, 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 1% холат, 1% Triton X-100 и 1 × протеазен инхибиторен коктейл за бозайници клетки [Sigma]). Студен SDS буфер за зареждане (0,05 mol/l Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерол, 100 mmol/l дитиотреитол и 0,1% бромфенолно синьо) се добавя към клетъчния лизат и се инкубира за 5 минути при 0 ° ° С. Пробите се зареждат върху 6% полиакриламидни гелове, подлагат се на електрофореза при 0 ° С и се визуализират чрез имуноблотинг с nNOS моноклонално антитяло (BD Transduction Laboratories) и конюгирано с пероксидаза вторично антитяло. За да се отделят цитоплазматичните и мембранно свързани фракции, се извършва проникване на дигитонин, както е описано по-горе (22), с изключение на използването на 10 μg/ml вместо 20 μg/ml дигитонин.

Статистически анализ.

Тъй като нивата на триглицеридите в плазмата също са повишени в нашите модели на мишки спрямо съответните им контроли (Таблица 1), ние изследвахме изолирани островчета, в които холестеролът може да бъде специално манипулиран. За да се определи дали директното изчерпване на холестерола може да подобри GSIS от изолирани островчета C57BL/6J, MβCD се използва в продължение на 1 час, за да предизвика остро изчерпване на клетъчния холестерол (9) и мевастатин (инхибитор на биосинтеза на холестерол), за да причини метаболитно изчерпване в продължение на няколко дни в културата ( 20). С тези лечения холестеролът на островчетата е намален с 30-40% (фиг. 2А), докато общото съдържание на инсулин остава незасегнато (фиг. 2Б). Директното изчерпване на холестерола от изолирани островчета значително подобрява секрецията на инсулин както при базална, така и при висока концентрация на глюкоза (фиг. 2С). Изчерпването на холестерола на ob/ob; apoE -/- островчета, използващи MβCD, също частично възстановява GSIS (фиг. 1С). GSIS (20 mmol/l глюкоза) е показан като функция на холестерола на островчетата за генетично модифицираните модели на мишки (фиг. 1D) или изолирани островчета от див тип с различни нива на холестерол (фиг. 2D). Въпреки че много фактори влияят върху секрецията на инсулин, във всички тези случаи нивото на холестерола на островчетата е обратно свързано с β-клетъчния GSIS.

Метаболизмът на глюкозата участва в регулирания от холестерола GSIS от β-клетките.

Холестеролът участва в nNOS регулирането на GK.

Предишни доказателства показват, че стимулираната от глюкоза транслокация на GK включва S-нитрозилиране на от nNOS (29). За да определим дали активността на nNOS влияе на GK в клетки с изчерпване на холестерола, ние изследвахме активността на nNOS, използвайки флуоресцентен индикатор NO, DAF-FM (4-амино-5-метиламино-2 ', 7′-дифлуорофлуоресцеин). Фигура 6А показва, че изчерпването на холестерола преди инсулинова стимулация предотвратява производството на NO, наблюдавано в контролните клетки. Тук се използва инсулин като стимулант, тъй като причинява по-бърза промяна в активността на nNOS от глюкозата (29). Инхибирането на производството на NO е в съответствие с наблюдението, че разрушаването на липидните микродомени от MβCD води до намалено освобождаване на NO от клетките, секретиращи инсулин (15). Добавянето на MβCD към βTC3 клетки в 2 mmol/l глюкоза води до намаляване на DAF-FM флуоресценцията, което показва, че клетъчното съдържание на NO се намалява при изчерпване на холестерола (фиг. 6В). Тези резултати предполагат, че активността на nNOS се инхибира от изчерпването на холестерола.

Тъй като модулацията на холестерола с помощта на MβCD се случва в рамките на 30 минути (30), неговият ефект върху активността на nNOS и GK е малко вероятно да работи чрез промени в генната транскрипция или стабилността на протеина. За да определим как изчерпването на холестерола може да намали активността на nNOS и да освободи GK от гранулите на инсулина, разгледахме ролята на богатите на холестерол мембранни микродомени при определянето на свойствата на nNOS. nNOS се локализира в инсулиновите гранули чрез взаимодействието му с трансмембранния протеин, свързан с инсолином протеин 2 в β-клетките на панкреаса (31). Характеризирането на nNOS показа, че естественият протеин е хомодимер (32) и димеризацията е абсолютно необходима за активността на nNOS (33). По този начин ние предположихме модел, при който изчерпването на холестерола нарушава димерите на nNOS, което от своя страна отслабва връзката между nNOS и GK, като по този начин освобождава GK в цитоплазмите, където се активира. Излишъкът от холестерол, от друга страна, стабилизира димерите на nNOS и поддържа GK свързан с инсулиновите гранули, където е по-малко активен (фиг. 6С).

ДИСКУСИЯ

Нашите резултати показват, че излишният клетъчен холестерол играе пряка роля при дисфункцията на панкреасните островчета и може да бъде ключов фактор в основата на прогресията на диабет тип 2. Използвайки различни животински модели, ние показваме, че повишеният серумен холестерол води до повишен холестерол в панкреатичните островчета. По-важното е, че нивата на холестерола на островчетата директно и значително влияят върху степента на GSIS, независимо от нивата на FFA. Това има голямо значение, тъй като показва съществуването на нов механизъм, свързващ хиперлипидемията и патогенезата на диабет тип 2, който е независим от FFA. Той също така предполага, че регулирането на клетъчния холестерол може да бъде потенциална цел за терапевтична интервенция, насочена към запазване или подобряване на GSIS функцията в β-клетките на панкреаса.

Доказано е, че VLDL е значително увеличен при апоЕ -/- мишки (36), а експозицията на VLDL води до намаляване на нивата на иРНК на инсулин в βTC3 клетки (37). Въпреки това, не открихме значителна разлика между контролните и апоЕ -/- мишки нито в плазмените нива на инсулин (Таблица 1), нито в общото островно съдържание на инсулин (Фиг. 1В). Разминаването може да се дължи на разликата в използваните клетки (култивирани клетки на инсулинома срещу островчета), съотношението на холестерола към триглицеридите на VLDL частиците (богат на триглицериди човешки VLDL срещу беден на триглицериди апоЕ -/- VLDL), или продължителността на времето на експозиция (краткосрочно спрямо хронично). Доказано е, че дефицитът на ApoE предизвиква по-голяма инсулинова чувствителност (38). Това може да обясни относително нормалния глюкозен толеранс при апоЕ -/- мишки въпреки намаления GSIS, наблюдаван в нашето проучване.

Поради дълбоките ефекти на холестерола върху липидната организация и клетъчните функции, клетките са формулирали цялостни механизми за поддържане на нивата на мембранния холестерол в тесни граници (39). Сред всички пътища на сигнална трансдукция, при които холестеролът може да участва в β-клетките, ние се фокусирахме върху ролята на богатите на холестерол мембранни домейни в GSIS и един молекулярен механизъм, по-специално включващ nNOS регулация на GK. Нашите данни показват, че изчерпването на холестерола води до промяна на съотношението nNOS димер към мономер, което от своя страна причинява транслокация на GK от гранули от инсулин в цитоплазмата, където се активира. За разлика от това, излишъкът от холестерол предотвратява активирането на GK, като поддържа GK свързан с инсулиновите гранули. Понастоящем се провеждат допълнителни проучвания за предоставяне на допълнителни подробности за други пътища на GSIS, които също могат да бъдат засегнати от модулацията на холестерола.