Не-невронални клетки

Тази статия е част от изследователската тема

Имунни отговори при неврологични разстройства: сложната мрежа за взаимодействие, свързваща имунните периферни клетки на микроглията, астроцитите и нашествениците Вижте всички 15 статии

Редактиран от
Алберт Жиралт

Университет в Барселона, Испания

Прегледан от
Seong-Woon Yu

Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology (DGIST), Южна Корея

Франческо Миро

Institut de Recerca Biomèdica August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Испания

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

предизвиква

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по неврология, Неврологичен институт в Тиендзин, Обща болница в Медицинския университет в Тянжин, Тянжин, Китай
  • 2 Ключова лаборатория за невроремонт и регенерация след невротравма в централната нервна система, Неврологичен институт в Тиендзин, Министерство на образованието, Тиендзин, Китай
  • 3 Център за неврологични заболявания, Болница за трети хора в Датун, Шанси, Китай
  • 4 Китайски национален център за клинични изследвания за неврологични заболявания, болница Тиантан в Пекин, Медицински университет в столицата, Пекин, Китай
  • 5 Център за напреднали иновации за защита на мозъка на човека, Медицински университет в столицата, Пекин, Китай
  • 6 Пекинска ключова лаборатория по транслационна медицина за цереброваскуларна болест, Пекин, Китай

Заден план: Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е често срещано чернодробно заболяване, характеризиращо се със значително натрупване на липиди в черния дроб без прекомерна консумация на алкохол. Натрупващите се данни показват значително повишен риск от интрацеребрален кръвоизлив (ICH) при пациенти с NAFLD. Въпреки това остава слабо разбрано дали и как NAFLD влияе върху резултата от хеморагична мозъчна травма. Тук изследвахме ефектите от индуцираната от диетата NAFLD върху увреждане на ICH и невровъзпаление при мишки.

Методи: NAFLD се индуцира при мишки C57BL/6 чрез хранене с диета с дефицит на метионин-холин (MCD) в продължение на 4 седмици. Моделите на колагеназа и автоложна кръв бяха използвани за оценка на ефектите от NAFLD върху увреждане на ICH и невро възпаление.

Резултати: MCD диетата за 4 седмици предизвиква NAFLD и хиперлипидемия при мишки. Мишките, получаващи MCD диета, имат влошен неврологичен дефицит и мозъчен оток след ICH. Увеличаването на увреждането на ICH беше придружено от мозъчна инфилтрация на неутрофили и моноцити и повишено производство на провъзпалителни фактори. Преди ICH, MCD-индуцирана мобилизация на неутрофили и моноцити в периферията. По-специално, вредното въздействие на NAFLD върху нараняването на ICH е премахнато при мишки, получаващи изчерпване на антитела от неутрофили и моноцити.

Заключения: Тези резултати предполагат, че NAFLD изостря невро възпалението и увреждането на ICH.

Въведение

Вътремозъчният кръвоизлив (ICH) е тежък вид инсулт без ефективно лечение (Aronowski and Zhao, 2011). Епидемиологичните проучвания установяват, че факторите на околната среда и диетата са свързани с честотата и резултата след ICH. Сред факторите, които повишават риска от ICH, безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е често срещано чернодробно заболяване, което засяга до 30% от общото население (Tsochatzis and Newsome, 2018). NAFLD се характеризира с прекомерно отлагане на липиди в чернодробния паренхим, независимо от тежката консумация на алкохол (Kim et al., 2011; Younossi et al., 2018; Khoury et al., 2019). Придружаващи натрупването на чернодробна мазнина, пациентите обикновено показват инсулинова резистентност, дислипидемия и ескалиращо системно възпаление (Gluchowski et al., 2017; Fiorucci et al., 2018). Въпреки това остава неуловимо дали и как NAFLD влияе върху резултата от ICH.

Възникващите доказателства демонстрират възпалението като ключов елемент, който допринася за вторично мозъчно увреждане след ICH (Zhou et al., 2014). След иктуса на ICH, кръвните компоненти, включително левкоцитите, се вливат в мозъка и активират резидентни глии и набират имунни клетки като неутрофили и моноцити (Mracsko et al., 2014; Sheth and Rosand, 2014; Zhang Z. et al., 2017) . Тези възпалителни събития ускоряват развитието на перигематомен оток и неврологично влошаване (Haukeland et al., 2006; Farrell et al., 2012; Gao and Tsukamoto, 2016). Клиничните проучвания показват, че пациентите с NAFLD се характеризират с увеличаване на системното възпаление, характеризиращо се с повишена мобилизация на циркулиращи възпалителни клетки, което предполага, че NAFLD вероятно предизвиква мобилизация на периферни имунни клетки. И все пак влиянието на такава мобилизация върху патологичните отговори на ICH остава неизвестно. За да отговорим на този въпрос, индуцирахме NAFLD чрез хранене на мишки с диета с дефицит на метионин-холин (MCD) и изследвахме ефектите на NAFLD върху хеморагично увреждане и невро възпаление, използвайки два ICH модела.

Материали и методи

Животни

Експерименталните протоколи бяха одобрени от институционалните комитети за грижа и употреба на животните на Общата болница в Медицинския университет в Тиендзин. Всички експерименти са проектирани, проведени и докладвани съгласно ARRIVE (Animal Research: докладване на in vivo Експерименти) насоки. Мъжки мишки C57BL/6 (на 12 седмици) са закупени от Vital River Corporation (Пекин, Китай). Мишките бяха настанени в условия, свободни от патогени, със свободен достъп до храна и вода. Всички операции на мишки се извършват под упойка. Всички мишки бяха разпределени на случаен принцип за всеки експеримент.

Индукция на ICH в мишки

Както вече съобщихме, ICH се индуцира при мишки чрез инжектиране на автоложна кръв или бактериална колагеназа (Li et al., 2017a, b; Ren et al., 2018). Първо, мишките бяха анестезирани с интраперитонеална инжекция на кетамин (100 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg). След поставянето на мишките върху стереотактична рамка, отдясно на черепа беше пробит 1-милиметров отвор (2,3 mm странично от средната линия, 0,5 mm пред брегмата). За модела на колагеназа ICH, 0,0375U бактериална колагеназа (тип IV-S, Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ), разтворена в 0,5 μl физиологичен разтвор, се влива в опашкото ядро ​​(3,7 mm дълбочина под черепа) чрез инфузионна помпа ( Kd Scientific Inc., Holliston, MA, USA) със скорост от 0,5 μl/min. В някои експерименти индуцирахме модела ICH на мишка чрез вливане на автоложна кръв, използвайки метод на двойно инжектиране. Пълна кръв (30 μl) се изтегля от ъгловата вена и след това се влива в мозъка, както е описано по-рано (Sun et al., 2016). Първо се инжектират 5 μl кръв за генериране на съсирек на дълбочина 3 mm под дупката. След това иглата се премести на дълбочина 3,5 mm, за да се инжектират останалите 25 μl кръв със скорост 1 μl/min. След операцията животните бяха поставени в клетки и им беше осигурен свободен достъп до храна и вода.

Проектиране на проучвания и управление на лекарства

В това проучване са използвани общо 207 мъжки мишки C57BL/6. Мишките бяха разпределени на случаен принцип към всяка група според вида на чау, който им беше даден. Диета с дефицит на метионин-холин (MCD) (H10401, Beijing HFK Bioscience Company Limited) е хранена в продължение на 4 седмици, за да се получи животинският модел на NAFLD преди ICH индукция. Мишките, хранени с нормалната диета, бяха използвани като контроли. Това администриране продължава в края на експеримента (Larter and Yeh, 2008; Zhang et al., 2014). Моделът на ICH на мишката се индуцира чрез инфузия на колагеназа или автоложна кръв на ден 0. Провеждат се поредица от оценки в определени часови точки след ICH. За експеримента с изчерпване на клетките Gr-1 + антимиши Gr-1 моноклонални антитела (MAb-RB6-8C5; BioXcell, Западен Ливан, NH, САЩ) бяха доставени чрез интраперитонеална инжекция 1 ден преди и 1 ден след ICH индукция при доза от 250 μg на мишка (Condamine et al., 2014; Wang et al., 2015). Повече от 90% от Gr-1 + клетките бяха изчерпани при мишки, получаващи анти-миши Gr-1 моноклонални антитела. Всички данни бяха анализирани от независими разследващи, заслепени за разпределението на групата.

Оценка на поведението

Оценката на поведението беше извършена в определени часови точки след ICH операция за оценка на двигателните, сензорните, рефлекторните и балансиращите функции. Модифицираната оценка на неврологичната тежест (mNSS), тест за завиване в ъгъла, заедно с теста за повреда на крака бяха проведени, както е описано по-рано (Clarkson et al., 2010; Klebe et al., 2017; Ren et al., 2018) Диапазонът от оценки за mNSS е от 0 до 18 и на мишките е дадена 1 точка за невъзможността да изпълнят дадена задача. Тестът за завиване на ъглите е използван за оценка на сензорно-моторни и постурални асиметрии. Накратко, всяка мишка свободно преминава в ъгъл с ъгъл 30 градуса и след това се обръща надясно или наляво, за да излезе. Тази задача се повтаря 10 пъти с интервали от поне 30 s между опитите. Процентът на десните завои беше изчислен и записан. За изпитването на повреда на крака, мишките бяха поставени върху решетъчно устройство с размери 32 cm × 20 cm × 50 cm (дължина × широчина × височина) с 12 mm мрежа и се оставиха да се движат свободно за 5 минути. Дефект на крака се дефинира като мишката пуска крайника си в дупката на решетката или си почива с решетката на нивото на китката. Процентът на грешките на краката се изчислява по формулата: крак грешки/(крак грешка + стъпки грешка на краката) × 100.

Измерване на съдържанието на вода в мозъка

Съдържанието на вода в мозъка беше оценено на 3-ия ден след ICH индукция, както беше описано по-рано (Han et al., 2017). Накратко, мозъчните мозъци бяха отстранени без перфузия и дисецирани на три части: ипсилатералната, контралатералната и малкия мозък. Събраните тъкани се претеглят незабавно, за да се получат мокри тегла и след това се сушат в продължение на 24 часа при 100 ° С, за да се получат сухи тегла. Процентът на водното съдържание се изчислява по формулата: (мокро тегло-сухо тегло)/мокро тегло × 100%.

Поточна цитометрия

Верижна реакция на полимераза в реално време

Три дни след ICH индукция, общата РНК беше извлечена от ипсилатералното полукълбо на мозъчната тъкан, използвайки реагент Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията на РНК се измерва с ултравиолетова спектрофотометрия при 260/280 nm. След това общата РНК се транскрибира обратно в сДНК, използвайки реактивния комплект PrimeScript ™ RT (TaKaRa, Shiga, Япония). Всички процедури бяха проведени според указанията. SYBR Green PCR Master Mix (Roche, Indianapolis, IN, USA) беше използван за усилване на генните последователности в системата за откриване на PCR в реално време Opticon 2 (BioRad, Hercules, CA, USA). Праймерите, използвани в този експеримент, са изброени в допълнителна таблица S1. GAPDH служи като референтен ген и mRNA експресията се изчислява като кратни промени, използвайки метода 2 ΔΔCt. Последователностите на праймерите, използвани за RT-PCR анализ в това проучване, са изброени в допълнителна таблица S1.

Оценка на пропускливостта на BBB

На 3-ия ден след ICH пропускливостта на BBB беше измерена чрез количествено определяне на екстравазацията на Evans Blue (Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ), както е описано по-рано (Zhang Y. et al., 2017; Ren et al., 2018). Evans Blue (2% във физиологичен разтвор, 4 ml/kg) се инжектира през опашната вена 2 часа преди събирането на мозъка. мишките се анестезират с 10% хлоралхидрат и се перфузират с PBS. След обезглавяването мозъците бяха извадени и плочи. След това тъканите бяха снимани за качествен анализ. За количествен анализ мозъчните тъкани бяха отстранени, претеглени и поставени в диметилформамид. След хомогенизиране, сместа се инкубира в продължение на 72 часа във водна баня с температура 60 ° С и се центрофугира при 1500 ж за 10 минути. Стойността на абсорбция на супернатанта беше измерена с флуоресцентния спектрофотометър. Съдържанието на тъкан в Evans Blue се определя количествено от линейна стандартна крива.

Хематоксилин и еозин (H&E) петно, маслено червено O петно

След като мишките получават MCD диета или контролна диета в продължение на 4 седмици, чернодробните тъкани се събират и фиксират с помощта на 4% параформалдехид. След това се приготвят срезове с дебелина 8 μm с микротом (Leica Biosystems, Nussloch, Германия). След обезпаразитяване и рехидратиране, тъканните секции бяха оцветени с H&E с помощта на търговски комплект (Solarbio, Пекин, Китай). Микроскопските изображения са получени с помощта на микроскоп (Олимп, Токио, Япония). За петно ​​Oil Red O, фиксираните чернодробни тъкани бяха вградени с OCT и нарязани на участъци с дебелина 8 μm. След измиване в дестилирана вода филийките се накисват в 60% изопропилов алкохол за 20-30 s. След това резените бяха поставени в резервоар за боядисване, напълнен с модифициран маслено червен разтвор за оцветяване (G1261, Solarbio Life Sciences) и оцветени за 10-15 минути на тъмно. След отделяне и измиване, резените бяха оцветени с разтвор на хематоксилин в продължение на 1-2 минути, за да се разкрият ядрата. Накрая, резените бяха монтирани с глицериновия желатин за наблюдение.

Оценка на триглицеридите (TG)

Липидите в серума и черния дроб се измерват съгласно ръководството на комплекта за анализ на триглицериди (A110-2-1, Институт по биоинженерство в Нанкин Jiancheng, Нанкин, Китай). Триглицеридите (TG) от серумни и чернодробни проби се оценяват чрез ензимен колориметричен метод GPO-PAP. Цялата кръв се центрофугира за отделяне на серума. За чернодробната тъкан супернатантата беше центрофугирана и събрана след хомогенизиране. Пробата се смесва с работния разтвор и се инкубира за 10 минути при 37 ° С. Абсорбцията е измерена при 510 nm. Съдържанието на триглицериди се измерва чрез изчисляване на стойността на абсорбция на стандарта и пробата.

Измерване на времето на коагулация и времето на кървене

За да се оцени времето на коагулация на мишките, кръвта се взема от ъгловата вена с помощта на стъклен капиляр след анестезия. След това тръбата, пълна с кръв, беше поставена на плосък връх. Равна дължина на капилярната тръба се счупва на всеки 30 s, докато се образува фибринова нишка. Що се отнася до времето на кървене на мишките, използвахме острие на скалпел, за да пресечем опашката, започвайки от 2 мм от върха. Опашката беше потопена в прозрачна епруветка, пълна с физиологичен разтвор при 37 ° С. Времето за кървене се определя като време за спиране на кървенето. Максималното време за наблюдение е 20 минути. Ако няма кървене в рамките на 30 s, то се счита за спряно.

Статистически анализ

Размерът на пробата се определя чрез анализ на мощността, като се приема ниво на значимост от α = 0,05 с 80% мощност, за да се оценят значимите разлики. Извършихме анализа на мощността и изчисленията на размера на извадката, използвайки софтуера SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, САЩ). Данните бяха анализирани от най-малко двама следователи, заслепени за групиране. Всички стойности са показани като средна стойност ± SD. Статистическите анализи бяха проведени с помощта на софтуера Graphpad 6.0. Несдвоеният 2-опашен студент т-тестът е използван за определяне на значимостта на разликите между двете групи и индексът на оцеляване е анализиран чрез Log-rank (Mantel-Cox) тест. P високо CD11b + Ly6G +) и моноцити (CD45 високо CD11b + Ly6G - Ly6C високо) са значително увеличени при NAFLD мишки в сравнение с контролните мишки на 3-ия ден след ICH, но микроглии и лимфоцити, включително Т клетки и В клетки, не се различават значително между тях две групи (фигури 3А-С). Освен това, данните от RT-PCR показват, че NAFLD също е увеличил нивата на иРНК на IL-1β, CCL2, CXCL2 и MMP9 в ипсилатералното полукълбо след ICH, повечето от тези гени са свързани с инфилтрацията и функцията на миелоидните клетки (Фигура 3D).

Фигура 6. Вредният ефект на NAFLD е премахнат при ICH мишки, изчерпани от миелоидни клетки. (А) Блок-схема илюстрира приложението на лекарството и експерименталния дизайн. NAFLD или контролни мишки получават anti-Gr-1 mAb или IgG 1 ден преди и 1 ден след ICH. Преди ICH и в дни 1 и 3 след ICH се оценяват неврологичните дефицити и съдържанието на вода в мозъка. (Б) Резултати от съдържанието на вода в мозъка на мишки, получаващи посочени лечения на ден 3 след ICH. н = 10 на група. (° С) Статистически данни за оценка на неврологични дефицити, включително mNSS тест, тест за завиване на ъгъла и резултат от тест за грешка в крака при посочени групи мишки. н = 10 на група. Данните са представени като средно ± SD. *P Ключови думи: вътремозъчен кръвоизлив, NAFLD, невровъзпаление, миелоидни клетки, имунен отговор

Цитиране: Li X, Cheng X, Wang X, Liu Q, Ma H и Li M (2020) Дислипидемичната диета предизвиква мобилизация на периферни неутрофили и моноцити, които обострят хеморагичните мозъчни наранявания и невровъзпаления. Отпред. Клетка. Невроски. 14: 154. doi: 10.3389/fncel.2020.00154

Получено: 28 февруари 2020 г .; Приет: 11 май 2020 г .;
Публикувано: 08 юни 2020 г.

Алберт Жиралт, Университет в Барселона, Испания

Francesc Miro, August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), Испания
Seong-Woon Yu, Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology (DGIST), Южна Корея