Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

дългосрочната

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Отделение по анатомия, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Отделение по медицина към Медицинския университет в Шига, Оцу, Шига, Япония

Отдел по молекулярна биология, Институт за изследване на генома, Университетът в Токушима, Курамото, Токушима, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Отделение по анатомия, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

Отдел по молекулярна биология, Институт за изследване на генома, Университетът в Токушима, Курамото, Токушима, Япония

Трета катедра по вътрешни болести, Отдел по диабет, ендокринология и метаболизъм, Медицински факултет на университета Киорин, Митака, Токио, Япония

  • Кейко Ханда,
  • Kouichi Inukai,
  • Хирохиса Онума,
  • Акихико Кудо,
  • Фумиюки Накагава,
  • Казуе Цугава,
  • Ацуко Китахара,
  • Рие Мория,
  • Казуто Такахаши,
  • Йошиказу Сумитани

Корекция

16 май 2016: Handa K, Inukai K, Onuma H, Kudo A, Nakagawa F, et al. (2016) Корекция: Дългосрочната диета с ниско съдържание на въглехидрати води до вредни метаболитни прояви при мишки с диабет. PLOS ONE 11 (5): e0155751. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155751 Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Цитат: Handa K, Inukai K, Onuma H, Kudo A, Nakagawa F, Tsugawa K, et al. (2014) Дългосрочната диета с ниско съдържание на въглехидрати води до вредни метаболитни прояви при мишки с диабет. PLoS ONE 9 (8): e104948. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104948

Редактор: Джули А. Чоуен, Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, CIBEROBN, Испания

Получено: 25 март 2014 г .; Прието: 14 юли 2014 г .; Публикувано: 29 август 2014 г.

Наличност на данни: Авторите потвърждават, че всички данни, лежащи в основата на констатациите, са напълно достъпни без ограничения. Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено от Grant-in-Aid за научни изследвания №. 25350898 (на KI) от Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите на Япония. URL адрес: http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите нямат конфликт на интереси, свързани с тази статия, за да декларират.

Въведение

През последното десетилетие определянето на подходящи диетични интервенции беше източник на противоречия. Диетите с ниско съдържание на въглехидрати са във фокуса на значителен интерес. Терапевтичните ефекти на диетите с ниско съдържание на въглехидрати са подробно изследвани в няколко клинични състояния, включително затлъстяване, метаболитни нарушения, сърдечно-съдови събития и смъртност [1], [2], [3], [4], [5], [6], [ 7]. В краткосрочни проучвания до една година [1], [2], [3], пациентите със затлъстяване, консумиращи средиземноморска или друга нисковъглехидратна диета, показват по-благоприятни условия по отношение на затлъстяването, дислипидемията и гликемичния контрол. Направените изводи обаче бяха ограничени от дизайна на изследването, т.е. малък брой, кратки периоди и лошо спазване на специални диети. Продължителната безопасност и ефикасност на диета с ниско съдържание на въглехидрати за управление на риска от сърдечно-съдови заболявания все още не е определена.

Наскоро в проспективно кохортно проучване [4] беше показано, че диетите с ниско съдържание на въглехидрати и високо протеини са свързани с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания. Освен това се съобщава, че въглехидратно ограничената диета увеличава смъртността [5]. По този начин клинично се установяват вредни ефекти от диетите с ниско съдържание на въглехидрати през последните години. Въпреки това, научният механизъм, чрез който диетата с ниско съдържание на въглехидрати оказва отрицателно въздействие върху здравето на съдовете, остава неадресиран.

Към днешна дата повечето проучвания върху гризачи са фокусирани върху изключително нисковъглехидратна, високомаслена диета (HFD), така наречената кетогенна диета (KD) [8], [9], [10], [11]. Тези мишки показаха загуба на тегло, вероятно поради намален прием на храна [8], [9]. Всъщност намаляването на хранителните въглехидрати е придружено от увеличаване на хранителните мазнини и протеини. Въпреки това би било невъзможно пациентите да продължат да консумират KD за продължителен период. От практическа гледна точка при модели на гризачи трябва да се изследва диета с ниско съдържание на въглехидрати и умерено висок състав на мазнините.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички животински протоколи са извършени съгласно Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни в университета в Киорин. Протоколът е одобрен от Комитета по етика на опитите с животни от университета в Киорин (одобрен номер: 2014-152).

Животни

Тест за интраперитонеален глюкозен толеранс и инсулинов толеранс

За тестове за толерантност към глюкоза, мишките са гладували за 8 часа и се прилага интраперитонеално 10% разтвор на глюкоза (2 mg/g тяло за див тип мишки, 1,5 mg/g · тяло за мишки с диабет), както е описано по-рано [13]. Измерванията на глюкозата бяха проведени преди инжектирането и на 30, 60 и 120 минути след инжектирането. За тестове за инсулинова толерантност, мишките в постпрандиално състояние са интраперитонеално инжектирани с 1,0 U/kg · човешки инсулин (Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA). Измерванията на глюкозата бяха проведени преди инжектирането и на 30, 60 и 90 минути след инжектирането. Плазмените нива на глюкоза се измерват с помощта на глюкозен анализатор (Sanwa Kagaku Kenkyusho, Co., Nagoya, Japan).

Измервания на биомедицински маркери

Преди жертвоприношението животните са гладували за 8 часа. Кръвните проби се събират чрез сърдечна пункция с помощта на хепаринизирани спринцовки и се центрофугират при 12 000 rpm в продължение на 5 минути. Анализите на серумни липиди са извършени в Центъра за анализ на Skylight-Biotech (Акита, Япония). Концентрациите на хормони бяха измервани с търговски достъпни методи, т.е. имунореактивен инсулин (IRI) беше измерен чрез радиоимуноанализ (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Йокохама, Япония) и серумен растежен фактор на фибробластите 21 (FGF21) от Quantikine ELISA Mouse/Плъх FGF-21 (R&D системи, Минеаполис, MN, САЩ). Чернодробните триглицериди (TG) се екстрахират по методите на Bligh и Dyer [14] и се анализират, като се използва търговски реагент за TG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Осака, Япония). Урината беше анализирана за кетони, креатинин и албумин, използвайки стандартна лабораторна техника.

Анализ на мастни киселини с помощта на HPLC

Количествен анализ на чернодробна иРНК и протеини

Имунохистохимия за маркери на чернодробния оксидативен стрес (4-HNE и 8-OHG)

Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± SE. Трансформацията на дневника на непрекъснатите променливи се използва, когато е необходимо, за да се задоволят изискванията за разпределение за параметрични тестове. Сравненията между две групи бяха направени с t-тест на Student. За сравнение между три групи е използван еднопосочен ANOVA с теста на Tukey. Стойност на P Фигура 1. Промени в телесното тегло, теглото на черния дроб, теглото на епидидималните мазнини и съдържанието на чернодробен TG във всяка група (n = 6).

(A) Мишки от див тип (ляв панел), STZ (среден панел) и KKAy (десен панел) са хранени по двойки със стандартна чау (SC диета, плътни линии), ниско съдържание на въглехидрати (LC диета, прекъснати линии) или силно въглехидратно ограничена диета (SR диета, пунктирани линии) в продължение на 16 седмици. Чернодробно тегло (B), тегло на епидидимална мазнина (C) и съдържание на TG в черния дроб (D) са анализирани във всяка група в края на проучването (ред 1: WSC, ред 2: WLC, ред 3: WSR, ред 4: SSC, ред 5: SLC, ред 6: SSR, ред 7: KSC, ред 8: KLC, ред 9: KSR). * p Таблица 2. Биохимични параметри на всяка група.

В интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза, WSR и KSR показват изразена глюкозна непоносимост в сравнение с WSC и KSC, съответно, мишки (Фиг. 2А, 2В). При STZ мишки няма значителни разлики между трите диети, което предполага, че влошаването на глюкозния толеранс поради дефицит на инсулин е толкова поразително, че диетичните ефекти върху непоносимостта към глюкоза могат да бъдат незначителни. При теста за инсулинова толерантност (фиг. 2C, 2D) чувствителността към инсулин е намалена при мишки, хранени със SR диета, в сравнение с тези, даващи SC диета, и това намаление зависи от количеството въглехидрати в диетата. Тези резултати показват, че диетата с ниско съдържание на въглехидрати оказва вредно въздействие върху инсулиновата чувствителност както при диабетни, така и при недиабетни мишки.

(A) Мишки, хранени с SC диета (плътни линии), LC диета (пунктирани линии) и SR диета (пунктирани линии) са гладували в продължение на 8 часа и глюкозният разтвор се прилага интраперитонеално (2 mg/g тяло за див тип мишки, 1,5 mg/g · тяло за мишки с диабет). (B) Изчислява се площ под кривата (AUC), за да се измери степента на нарушение на глюкозния толеранс. (C) Мишки в постпрандиални състояния се инжектират интраперитонеално с 1,0 U/kg · човешки инсулин. (D) AUC е изчислена за измерване на степента на увреждане на инсулиновия толеранс. * p Фигура 3. Скрининг за причината за непоносимост към глюкоза чрез изследване на нивата на чернодробна транскрипция на различни гени при див тип, STZ и KKAy мишки, хранени с SC или SR диета.

Чернодробните mRNA експресии на всеки от гените при див тип (A), STZ (B) и KKAy (C) мишки, хранени с SC или SR диета, бяха оценени чрез RT-PCR и представени като увеличаване на гънките в сравнение с мишки, хранени с SR диета. * p Фигура 4. Чернодробна експресия на иРНК и серумни нива на FGF21.

Нивата на иРНК на FGF21 от див тип (A), STZ (B) и KKAy (C) мишки бяха анализирани чрез количествена PCR в реално време. Нивата на серумен FGF21 (D) бяха измерени с помощта на комплект ELISA (линия 1: WSC, линия 2: WLC, линия 3: WSR, линия 4: SSC, линия 5: SLC, линия 6: SSR, линия 7: KSC, линия 8: KLC, линия 9: KSR мишки). * p Фигура 5. нива на иРНК и протеин на PGC1α в WAT.

(А) нивата на PGC1α иРНК от див тип и KKAy мишки бяха анализирани чрез RT-PCR. * p Фигура 6. Чернодробна SCD1 иРНК и нива на протеин от див тип, STZ и KKAy мишки.

Съотношенията C16: 1/C16: 0, C18: 1/C18: 0 (A) и C18: 0/C16: 0 (B) бяха изчислени въз основа на данни, получени от анализа на серумните мастни киселини (ред 1: WSC, ред 2: WLC, ред 3: WSR, ред 4: KSC, ред 5: KLC, ред 6: KSR). Нивата на тРНК на SCD1 (C) и Elovl6 (D) на всички миши модели бяха анализирани чрез количествена PCR в реално време (бяла лента: мишки, хранени с диета SC, сива лента: мишки, хранени с LC диета, черна лента: мишки, хранени с диета SR) . Чернодробните нива на SCD1 протеин от див тип (E), STZ (F) и KKAy (G) мишки бяха анализирани чрез Western blot. В средните панели са представени представителни данни (две проби за всяка група). В долните панели всяка колона показва средната стойност ± S.E. получени от 6 мишки (бяла лента: мишки, хранени с SC диета, сива лента: мишки, хранени с LC диета, черна лента: мишки, хранени с SR диета). Горните панели показват вътрешния контрол, използващ анти-β актинови антитела. * p Фигура 7. Имунохистохимия за 4-HNE и 8-OHG.

Три оптични полета на участъци от всяко животно (n = 3) бяха избрани на случаен принцип и микрофотографирани. Оригиналното увеличение е × 50. Интензивността на оцветяването се определя количествено, като се използва изображение J. Цветните изображения първо се подлагат на цветна деконволюция с помощта на приставката на G. Landini, за да се получат отделни изображения на DAB и хематоксилин в сива скала. Измерихме средната оптична плътност на DAB оцветяване в цитоплазмата за 4-HNE (A) и тази в областта на ядрата за 8-OHG (B), като приложихме бинарни маски на ядра, създадени от изображения на хематоксилин, и оценихме интензивността на оцветяването . Горните панели са отрицателни контроли, липсват първични антитела. Едно представително изображение на мишки от див тип (средни панели) и KKAy (долни панели), хранени с SC диетата (леви панели: без оцветяване с хематоксилин, средни панели: с оцветяване с хематоксилин) и диетата SR (десни панели: с оцветяване с хематоксилин) е представени. Графиките отдясно на стълбовете показват средните стойности на интензивността на оцветяване. * p Таблица 3. Състав на мастните киселини на всяка група (mg/mL).

Дискусия

Тъй като целта на това проучване беше просто да се изследват ефектите на различни макронутриенти върху биологичните фенотипове при диви и диабетни мишки, не можахме да подготвим съответни контролни мишки, т.е. STZ мишки срещу PBS инжектирани мишки или KKAy срещу KK мишки. По този начин, нашите наблюдения не ни позволяват да правим изводи за разликите между животинските модели. В предварителен експеримент подготвихме STZ мишки по конвенционален метод [24]. Въпреки това, STZ мишките, хранени със SR диета (SSR мишки), не оцеляват повече от седмица след инжектирането, което може да се дължи на тежка кетоацидоза. По този начин променихме протокола и инжектирахме по-малко количество STZ, както е споменато в Методите. С тази модификация, STZ мишките, използвани в нашето проучване, показват по-малко повишаване на глюкозата в плазмата и по-високи нива на инсулин на гладно от STZ мишките, описани по-рано [24], което показва, че тези мишки не са като моделите на диабет тип 1, вместо да приличат на модели на диабет тип 2 с изтощение на β клетки.

Едно от ограниченията на нашето проучване е, че не можем да изключим възможността наблюденията ни да са били повлияни от диетите с високо съдържание на протеини, тъй като пропорциите на протеини и въглехидрати са обратно пропорционални. В съвсем скорошно проучване на гризачи е установено, че съотношението въглехидрати/протеини, а не приемът на калории, определя кардиометаболитно здраве, стареене и дълголетие при мишки [39]. Въпреки че нашите открития не ни позволяват да установим кой макронутриент, т.е. ниско съдържание на въглехидрати или високо съдържание на протеини, е вредно за здравето, заслужава да се отбележи, че нашите открития хвърлят светлина върху кардиометаболитните фенотипи, засегнати от съотношението карбоидрат/протеин.

Изследвахме дългосрочните ефекти на диета с ниско съдържание на въглехидрати върху модели на мишки с диабет. Тези мишки, когато се хранят с диета с ниско съдържание на въглехидрати, показват непоносимост към глюкоза, намаляват серумните нива на FGF21 и също така намаляват експресията на чернодробна SCD1. Всички тези намаления зависят от количеството въглехидрати в диетата. Забележително е, че тези прояви не са свързани с регулиране на теглото при мишки с диабет. Доколкото ни е известно, това е първият доклад, който показва, че диетата с ниско съдържание на въглехидрати води до вредни метаболитни прояви при мишки с диабет, което може да обясни тясната връзка между такива диети и високите рискове за сърдечно-съдови събития и заболеваемост, наблюдавани в клинични условия.

Благодарности

Благодарим на г-жа Томоко Миура за техническа подкрепа при експериментите с имунохистохимия.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: KI HK SO HI. Изпълнени експерименти: KH AK FN KT HO AK YS. Анализирани данни: RM TH. Допринесъл за написването на ръкописа: KI KT.