Резюме

Заден план

Наднорменото тегло и затлъстяването са широко разпространени хронични заболявания, дефинирани като прекомерно натрупване на мазнини, и са основни рискови фактори за няколко хронични заболявания, включително диабет тип 2, коронарна болест на сърцето, високо кръвно налягане и мастен черен дроб. Промените в начина на живот като повишена физическа активност и здравословна диета могат да бъдат ключови инструменти за лечение на затлъстяване. Прием на шипка, плод на няколко растения, принадлежащи към Розови е доказано, че намалява телесната мастна маса и предотвратява наддаването на телесно тегло. По този начин целта на проучването е да изясни потенциалните механизми, чрез които шипката инхибира затлъстяването, предизвикано от диета.

Методи

Мишките C57BL/6 J са хранени с високомаслена диета с (RH) или без (CTR) добавка на шипка в продължение на три месеца. Проследява се ин виво индиректната калориметрия, както и експресията на гени и нивата на протеини в различни мастни депа.

Резултати

Въпреки че не са открити разлики в енергийния прием в сравнение с групата на CTR, RH предотвратява наддаването на телесно тегло и намалява нивата на кръвната глюкоза, инсулина и холестерола. Индиректната калориметрия показа, че мишките, хранени с RH, имат значително по-висока ЕЕ по време на тъмната фаза, въпреки сравнимата доброволна активност. Освен това, когато се предизвикват с бягаща пътека, хранените с RH мишки показват по-висока скорост на метаболизма. Следователно, ние предположихме, че RH може да стимулира термогенния капацитет на кафявата мастна тъкан (BAT) или може да предизвика кафяво на бялата мастна тъкан (WAT). В сравнение с групата на CTR, експресията на гени и протеиновите нива на някои кафяви и “brite” маркери, заедно с гени, способни да насърчават диференциацията на кафявите адипоцити и термогенезата (като ucp1, tbx15, bmp7, и cidea), както и фосфорилирането на AMPK, се повишава в WAT (но не и в BAT) на RH-хранени мишки.

Заключения

Взети заедно, тези резултати показват, че диетичният шипка предотвратява наддаването на телесно тегло, като увеличава ЕЕ на цялото тяло и предизвиква покафеняване на WAT. По този начин той има потенциално терапевтично значение за лечение на затлъстяването и свързаните с него метаболитни нарушения.

Заден план

Затлъстяването е състояние, което води до преждевременна смърт поради няколко съпътстващи заболявания, като сърдечно-съдови заболявания [1], диабет тип 2 [2], хипертония [3] и рак [4, 5]. Мастната тъкан се състои от два функционално и морфологично различни типа тъкан, WAT и BAT [6]. Една от основните роли на еднолокулярната ВАТ е съхраняването на триглицериди и освобождаването на мастни киселини и адипоцитокини, докато многолокулярната НДНТ също така разсейва енергията под формата на топлина чрез конститутивно изразения UCP1 [7, 8]. Друг подтип адипоцити с термогенен капацитет могат да се появят в рамките на WAT в отговор на различни стимули [9]. Тези клетки са наречени „brite“ (кафяво в бяло), „бежово“, „индуцируемо“ или „набираемо“ и достигат характеристики, типични за НДНТ, като високо митохондриално съдържание, многолокуларни липидни капчици и способност да изразяват специфични за BAT гени [9–12]. Тъй като откриването на НДНТ е налице и при възрастни хора [13–17], увеличаването на неговия термогенен капацитет или индуцирането на превръщането на бяла в бежова мазнина може да бъде терапевтична стратегия за затлъстяване, диабет и метаболитни нарушения [8].

Много фактори като лекарства, излагане на студ, адренергична стимулация и упражнения са в състояние да предизвикат потъмняване на бялата мазнина [8, 11, 18]. Някои хранителни компоненти също могат да повлияят на енергийната хомеостаза. Например ресвератрол [19], куркумин [20] или конюгирани линолова киселини [21] показват, че намаляват затлъстяването и предизвикват кафявоподобни адипоцити в WAT.

Шипката (RH) е плод на няколко растения от рода Роза, принадлежащи към Розови семейство и е богато на аскорбинова киселина [22], фенолни съединения [23] и каротеноиди [24]. Той упражнява анти-затлъстяване, противовъзпалително и антиоксидативно действие както in vivo, така и in vitro [25–30] и има полезни и облекчаващи болката свойства при лица с артрит [31–34]. Затлъстяването е резултат от дисбаланс между енергийния прием (EI) и енергийните разходи (EE) и целта на това проучване е да изясни механизмите, в основата на ефектите от затлъстяването на шипка.

Методи

Експериментални процедури с животни

Осемседмични мъжки мишки C57BL/6 J са закупени от Taconic, Дания. Животните се държат в контролирана температура (22 ° C) с 12:12 часа светлина: тъмно цикъл със свободен достъп до храна и вода. След една седмица на аклиматизация, мишките бяха разделени на случаен принцип в две групи (н = 12) и хранеше контролен HFD (CTR) или HFD, допълнен с шипка (RH) в продължение на 3 месеца. Изследването е одобрено от Местната комисия по етика на животните (Лунд, Швеция).

Диети

Двете експериментални диети съдържат 45 енергийни% от мазнини (Research diets, New Brunswick, NJ, USA) (Таблица 1). Прахът от шипка е получен от Orkla ASA, (Осло, Норвегия) и е анализиран от Eurofins Food & Agro Testing (Швеция). Въз основа на състава му (Таблица 2), съдържанието на макроелементи е балансирано в двете диети.

Тест за толерантност към глюкоза

Извършен е интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза (IPGTT) на 6-часови гладни мишки чрез инжектиране на 2 g/Kg D - (+) - глюкоза (SIGMA-Aldrich, Сейнт Луис, МО), последвано от вземане на кръв от проби от вената в епруветки, покрити с хепарин при 0, 30, 60 и 120 минути. Кръвните проби се центрофугират и плазмата се събира и анализира с Infinity ™ -глюкоза (Fisher Diagnostic, Middletown - VA) в съответствие с инструкциите на производителя.

Тест за инсулинова толерантност

Проведен е интраперитонеален тест за толерантност към инсулин (IPITT) на 4-часови гладни мишки чрез инжектиране на 0,75 U/kg инсулин (Actrapid®, Novo Nordisk, Дания). Кръвни проби се събират на 0, 15, 30 и 60 минути и нивата на кръвната захар се определят с Accu-check Aviva (Roche Diagnostic Gmbh, Германия).

Анализ на плазмата

В края на изследването кръвта се изтегля чрез орбитална пункция и се събира в епруветки, покрити с хепарин, от 10-часови гладни мишки, анестезирани с изофлуоран. Кръвта незабавно се центрофугира и плазмата се събира, замразява бързо и се съхранява при -80 ° C. За оценка на плазмените нива на инсулин, общ холестерол и триглицериди са използвани тестове за инсулин ELISA (Mercodia, Швеция), Infinity ™ -холестерол и Infinity ™ -триглицериди (Fisher Diagnostic, Middletown - VA) съгласно инструкциите на производителя.

Косвена газова калориметрия и поведенчески мониторинг

Енергийният метаболизъм на цялото тяло, приемът на храна и вода, както и доброволната двигателна и двигателна активност бяха измерени с PhenoMaster/LabMaster Home cage System (TSE-системи, Германия). Мишките се претеглят и аклиматизират в продължение на два дни преди експериментите. Всички параметри се записват на всеки 15 минути в продължение на 24 часа. Бяха проведени два 24-часови експеримента, които бяха усреднени за всяка мишка.

Измервания на бягаща пътека и непряка калориметрия

Експериментът е извършен с CaloTreadmill (TSE системи - Германия), настроен на 20% наклон след четиридневно обучение. Фракциите на ЕЕ, кислород и въглероден диоксид се наблюдават непрекъснато и се изчислява коефициентът на дихателен обмен (RER). Протоколно бягане: след поставяне на мишките в бягащата пътека скоростта леко се увеличава от 0–14 m/min за 5 минути, след това от 14–18 m/min за 15 минути, последвана от постоянно бягане при 18 m/min за 28 минути. След това скоростта намалява от 18 на 0 m/min за 1 min. Изтощението се определя като невъзможност за продължаване на редовното бягане.

Консумация на кислород в WAT и BAT

Бомбена калориметрия

Брутното енергийно съдържание във фекалиите се определя с бомбен калориметър (Parr Instrument Company - САЩ). Фекалиите се събират от еднокафяви мишки, сушат се лиофилно в продължение на 24 часа и се прави гранула от приблизително 1 g и се изгаря в кислородната бомба 1108P (Parr Instrument Company - USA) следвайки инструкциите на производителя.

Подготовка на РНК и количествена PCR в реално време

Общата РНК се изолира от тъканта, използвайки реагент за лизис на Qiazol (Quiagen Sciences, САЩ). Две μg РНК бяха третирани с DNase I (степен на усилване на DNase I; Invitrogen, СА) и след това обратно транскрибирани с помощта на произволни хексамери (Amersham Biosciences, NJ) и SuperScript II обратна транскриптаза (Invitrogen, CA). Количествените полимеразни верижни реакции в реално време бяха извършени с помощта на система ABI PRISM 7900 с праймери TaqMan bmp7 (Mm00432102_m1), ppargc1a (Mm01208835_m1), fgf21 (Mm00840165_g1), elovl3 (Mm00468164_m1) mb_m1_m1 ), car4 (Mm00483021_m1), tfam (Mm00447485_m1), nrf1 (Mm01135606_m1) и реагенти (Applied Biosystems, CA); Зелените грундове на Qiagen SYBR бяха Prdm16 (QT00148127), tbx15 (QT00148127), zic1 (QT00173502), tcf21 (QT00100688), ucp1 (QT00097300), cpt1 (QT00172564) и tbp (QT00198443). Всяка реакция се извършва в два екземпляра и резултатите се нормализират до геометричната средна стойност на два вътрешни контрола (Rps29 и Tbp).

Уестърн блотинг

Приблизително 50 mg тъкан се хомогенизират в лизисен буфер (50 mM Tris – HCl, pH 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM Na-ортованадат, 40 mM NaF, 4 mM Na-пирофосфат, 0,27 M захароза, 1 mM DTT, 20 μg/ml левпептин, 10 μg/ml антипаин и 1 μg/ml пепстатин) и впоследствие се центрофугира при 12 000 g в продължение на 20 минути при 4 ° C. Концентрацията на протеин в супернатантата беше определена с помощта на BCA-анализ (Pierce) и 20 μg протеини бяха разделени на NuPAGE 4–12% Bis-Tris гел (Life technology - Carlsbad, CA) и електроблотирани до нитроцелулозни мембрани (Amersham, GE Healthcare - Великобритания). Използвани първични антитела бяха: Cidea (Abin1858406 - Антитела онлайн), бета-актин (A5441 - Sigma), pAMPK (CST2535 - клетъчна сигнализация), AMPK (CST2603 - клетъчна сигнализация), PGC1α (Ab54481 - Abcam). Вторични антитела бяха: овчи анти-мишки (NA931V - GE Healthcare) и кози анти-заешки (31460 - Thermo Fisher).

Статистически анализ

Резултатите са представени като средни стойности ± SD. Статистическият анализ беше извършен с Graph-Pad Prism 6, използвайки несдвоени Student’s т-тест и двупосочен ANOVA, последван от Публикацията на Туки-hoc тест за набора от данни на бягащата пътека. Стойности на стр

Резултати

Добавката на RH предотвратява наддаването на тегло и оказва антидиабетни ефекти

В края на проучването мишките, хранени с RH, показаха намалено телесно тегло (фиг. 1а) и нива на глюкоза на гладно (фиг. 1б), въпреки подобни EI между двете групи (фиг. 1в). IPGTT разкри, че мишките, хранени с RH, са увеличили изхвърлянето на глюкоза (фиг. 1г), докато не са открити разлики след IPITT (фиг. 1д). В сравнение с групата на CTR, добавките с RH значително намаляват плазмените нива на общ холестерол и инсулин (фиг. 1f-g). Нивата на триглицеридите са сравними между двете групи (Фиг. 1h).

разходи

RH храненето увеличава EE, VO2 и VCO2

Експериментите с 24-часови калориметрични клетки не показват разлики в двигателната активност, движението на колелото или ЕЕ (фиг. 2а-в) между двете групи мишки. Въпреки това, когато се разглежда само тъмната фаза, хранените с RH животни показват отново подобна локомоторна (фиг. 2г) и колесна активност (фиг. 2д), но показват значително по-висока ЕЕ (фиг. 2е), което предполага, че повишената ЕЕ не се дължи до хиперактивност. Освен това, анализът на изпражненията разкрива значително по-високо енергийно съдържание след хранене с RH (фиг. 2g). В допълнение, предишен експеримент с консумация на кислород, извършен върху ех vivo WAT и BAT от женски мишки, показа, че дишането на митохондриите се увеличава при RH-хранене (Фиг. 3а и b), потвърждавайки новите in vivo резултати.

Добавката на RH увеличава метаболизма по време на упражнения с бягаща пътека

Тъй като физическите упражнения увеличават EE [35, 36] и активират програмата за покафеняване [18], предизвикахме двете групи мишки с бягаща пътека. Отново, индиректната калориметрия показва, че мишките, хранени с RH, имат значително по-високи EE (Фиг. 4а) и VO2 (Фиг. 4b), докато не са открити разлики в RER (4c). Интересното е, че една мишка от RH-групата не успя да завърши бягането, докато друга завърши теста, но стигна до дъното на бягащата пътека няколко пъти, преди незабавно да рестартира бягането. Всички CTR-мишки приключиха теста без проблем.

RH захранването повишава регулирането ucp1 и други маркери за НДНТ и brite в WAT

За да се изследва дали диетичната RH може да стимулира термогенната активност на НДНТ, анализирахме експресията на избрани гени от междукапуларното кафяво мастно депо. В сравнение с групата на CTR не са открити разлики в израза на ucp1 или някой от другите анализирани гени (фиг. 5а). След това изследвахме експресията на BAT- и brite-маркери в подкожната ингвинална WAT (scWAT). В това депа за мазнини, ucp1 беше значително по-високо регулирано от RH, както и bmp7, tbx15 и cidea (Фиг. 5б). Освен това сред маркерите за митохондриално окисление, cpt1 е значително увеличен (Фиг. 5б). Изразът на zic1, типичен НДНТ маркер, не беше открит и в двете групи (фиг. 5б). Уестърн блотинг анализ разкрива, че диетичната RH значително увеличава CIDEA и увеличава фосфорилирането на AMPK (фиг. 5в), докато тенденцията за повишени нива на PGC1α не достига значителни разлики (фиг. 5в).

Дискусия

Затлъстяването се развива от дисбаланс на енергийната хомеостаза, когато EI надвишава EE. Той представлява основен рисков фактор за развитието на диабет тип 2, дислипидемия, сърдечно-съдови заболявания и няколко други състояния. Нашите предишни проучвания показват, че RH е в състояние да предотврати наддаване на тегло [26], така че ние имаме за цел да изследваме механизмите, чрез които RH упражнява тези ефекти, предизвиквайки мишки C57BL/6 J с HFD, допълнен с RH.

В сравнение с групата на CTR, добавките с RH предотвратяват увеличаването на телесното тегло и намаляват нивата на глюкоза, инсулин и холестерол, въпреки че двете групи показват сходен EI. След това използвахме калориметрични клетки за измерване in vivo калориметрия с непряк газ. Въпреки че не са открити разлики по време на 24-часовото измерване, мишките, хранени с RH, показват по-висока EE по време на тъмната фаза, докато спонтанните колела и двигателни дейности са сравними между двете групи. Анализът на бомбената калориметрия показа, че изпражненията на мишки, хранени с RH, имат по-високо енергийно съдържание в сравнение с групата CTR, което показва, че RH намалява абсорбцията на чревна енергия. Този ефект най-вероятно допринася за ефекта на затлъстяване на RH. В допълнение, мишките, хранени с RH, показват по-висока скорост на метаболизма и по време на интензивни физически упражнения. Фактът, че една мишка от RH-групата е приключила теста на бягащата пътека преди края на експеримента, а друга е била близо, но не е стигнала до изтощение, може да отразява недостатъчно доставяне на мастни киселини, получени от мастна тъкан, до скелетните мускули, в резултат на по-високата способност за разединяване на митохондриите поради потъмняване.

Заедно с нивата на CIDEA протеин, фосфорилирането на AMPK също е повишено в RH групата. Голяма част от интереса към AMPK, генериран през последните години, се дължи на наблюдението, че неговата активност е намалена в повечето генетични модели на затлъстяване [42]. Съвсем наскоро Уанг и негови колеги демонстрираха, че ресвератролът индуцира образуването на кафявоподобни адипоцити в бяла мазнина чрез активиране на AMPK [19]. AMPK може също да фосфорилира PGC1α, за да увеличи митохондриалната биогенеза [43], а друго проучване показа, че AMPK е от съществено значение за диференциацията на кафявите адипоцити и покафеняването на WAT [44]. По този начин, повишеното фосфорилиране на AMPK, наблюдавано при хранене с RH, може да бъде важен механизъм за намаляване на затлъстяването и повишаване на EE, но изисква допълнително проучване.

Заключения

В настоящото проучване ние идентифицираме два възможни механизма, при които RH може да упражнява ефекти срещу затлъстяването. Първо, диетичният прием на RH предизвиква покафеняване на scWAT чрез повишено регулиране на някои BAT маркери и повишено фосфорилиране на AMPK. Второ, изглежда, че приемането на RH с храната намалява усвояването на чревната енергия. По този начин приемът на RH упражнява затлъстяване чрез ефекти както върху EE, така и върху EI. Необходими са потвърждаващи експерименти с хора, както и допълнителни механистични проучвания, за да се даде на RH „невероятно“ бъдеще като хранителна добавка за предотвратяване и лечение на затлъстяването и свързаните с него метаболитни нарушения.