Отделение по кардиология, Училище за сърдечно-съдови заболявания на CARIM, Факултет по здравеопазване, медицина и науки за живота, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

хипоксия

Отделение по кардиология, Училище за сърдечно-съдови заболявания на CARIM, Факултет по здравеопазване, медицина и науки за живота, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Специализиран отдел по радиология, Училище за сърдечно-съдови болести CARIM, Медицински център на Университета в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Специализиран отдел по радиология, Училище за сърдечно-съдови болести CARIM, Медицински център на Университета в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Отделение за респираторна медицина, NUTRIM School Nutrim, токсикология и метаболизъм, Университетски медицински център в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Отделение по кардиология, Училище за сърдечно-съдови заболявания на CARIM, Факултет по здравеопазване, медицина и науки за живота, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Допринесе еднакво за тази работа с: Ванеса П. М. ван Емпел, Паула А. да Коста Мартинс

Отделение по кардиология, Център за сърдечни съдове, Университетски медицински център в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Допринесе еднакво за тази работа с: Ванеса П. М. ван Емпел, Паула А. да Коста Мартинс

Отделение по кардиология, Училище за сърдечно-съдови заболявания на CARIM, Факултет по здравеопазване, медицина и науки за живота, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

  • Ела М. Поелс,
  • Никол Бич,
  • Джос М. Слентър,
  • М. Елин Коой,
  • Chiel C. de Theije,
  • Leon J. de Windt,
  • Ванеса П. М. ван Емпел,
  • Пола А. да Коста Мартинс

Фигури

Резюме

Заден план

Белодробната хипертония и последващата дяснокамерна (RV) недостатъчност са свързани с висока заболеваемост и смъртност. Прогнозата се определя от появата на RV неуспех. Понастоящем липсва адекватно лечение на RV недостатъчност. Следователно по-нататъшните изследвания на молекулярната основа за развитието на RV недостатъчност, както и разработването на по-добри миши модели на RV недостатъчност са наложителни. Предполагаме, че добавянето на диета с ниско съдържание на мед към хроничната хипоксия при мишки засилва техния индивидуален ефект и че комбинацията от леко белодробно съдово ремоделиране и капилярно разреждане предизвиква RV недостатъчност.

Методи

Шестседмични мишки са били подложени на нормоксия (N; 21% O2) или хипоксия (H; 10% O2) за период от 8 седмици и са получавали или нормална диета (Cu +), или диета с изчерпване на мед (Cu-). Сърдечната функция се оценява чрез ехокардиография и ЯМР анализ.

Резултати и заключение

Тук ние охарактеризирахме миши модел на хронична хипоксия, комбиниран с диета с изчерпване на мед и демонстрираме, че осем седмици хронична хипоксия (10%) са достатъчни за предизвикване на хипертрофия на RV и последващ отказ на RV. Добавянето на диета с ниско съдържание на мед към хипоксия не е имало допълнителни вредни ефекти върху ремоделирането на дясната камера.

Цитат: Poels EM, Bitsch N, Slenter JM, Kooi ME, de Theije CC, de Windt LJ, et al. (2014) Допълването на излагането на хипоксия с диета с изчерпване на медта не влошава ремоделирането на дясната камера при мишки. PLoS ONE 9 (4): e92983. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092983

Редактор: Джеймс Уест, Университетски медицински център Вандербилт, Съединени американски щати

Получено: 27 ноември 2013 г .; Прието: 27 февруари 2014 г .; Публикувано: 15 април 2014 г.

Финансиране: ЕП беше подкрепен с безвъзмездна финансова помощ от Stichting Sint Annadal, а PCM беше подкрепена от награда за кариерно развитие на Leducq и от холандската фондация за сърдечни фондове NHS2010B261 Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Паула да Коста Мартинс е член на редакционния съвет на PLOS ONE. Това не променя придържането на авторите към редакционните политики и критерии PLOS ONE.

Въведение

Белодробната хипертония (PH) и последващата деснокамерна (RV) недостатъчност са свързани с висока заболеваемост и смъртност. Прогнозата се определя главно от способността на RV да се адаптира към увеличеното допълнително натоварване, ключова характеристика на PH. [1] - [5] Малко се знае за механизмите, лежащи в основата на развитието на RV отказ и прехода на RV хипертрофия към RV отказ.

Има няколко животински модела за изследване на неуспех на RV. Най-често използваните модели са модели на гризачи, при които излагането на монокроталин или хипоксия предизвиква ремоделиране и провал на RV. [6], [7] Хроничната хипоксия предизвиква както вазоконстрикция, така и ремоделиране на белодробното съдово легло, което води до повишено белодробно налягане, което води до отказ на RV. [8], [9] Този модел е изследван предимно при плъхове, но скорошни проучвания показват, че мишките показват по-малко тежко белодробно съдово ремоделиране, когато са изложени на хронична хипоксия в сравнение с плъхове. [9] При мишки, хроничната хипоксия индуцира хипертрофия на RV и повишено систолично налягане в дясната камера (RVSP). [10] - [22] Въпреки че ефектът от хипоксията върху функцията на RV остава до голяма степен непроучен, малкото проучвания, които са разглеждали фракционно скъсяване или сърдечния обем на RV, не показват намаляване. [23], [24] Трябва обаче да се отбележи, че това включваше само краткосрочно излагане на хипоксия.

Други модели на белодробна хипертония на гризачи включват най-вече множество обиди, включително комбинацията от хронична хипоксия с инхибиране на VEGFR (SuHx) и лечение с монокроталин с пневмонектомия, за да се предизвика не само белодробно съдово ремоделиране, но и последваща RV недостатъчност. [14], [25] - [27] При мишки SuHx е единственият модел на двойна обида, описан по-рано, за да предизвика отказ на RV [14].

Bogaard и сътр. показа, че добавянето на изчерпана с мед диета към лента на белодробната артерия (PAB) при плъхове води до повишена фиброза на RV и дилатация на RV, както и до капилярно разреждане. [26] Диетата с ниско съдържание на мед пречи на HIF-1α протеиновата стабилизация, която е необходима за експресията на съдов ендотелен растежен фактор (VEGF) и следователно влияе впоследствие на ангиогенезата. [26], [28] При хипоксични условия площта на миофибрите се увеличава двукратно, което води до намаляване на плътността на капилярите, но малко увеличение на съотношението капиляри: фибри се разглежда в резултат на умерената пролиферация на капилярите, вторична за хипертрофия на RV. [29] Известно е, че поддържането на сърдечната функция по време на хипертрофия отчасти зависи от ангиогенезата и че липсата на експресия на VEGF допринася за прогресирането от адаптивна сърдечна хипертрофия до сърдечна недостатъчност [30], [31].

За разлика от това, диета с изчерпване на мед предотвратява развитието на тежка експериментална белодробна хипертония в модела на плъхове, която включва блокада на VEGF рецептор с хронична хипоксия (SuHx модел), чрез намаляване на заличаването на малките белодробни съдове [32].

През последните години възможностите за генно инженерство при мишки значително се развиха, което прави използването на мишките като животински модел изключително привлекателно. Следователно би било от полза да има миши модели на деснокамерна недостатъчност. Предполагаме, че диетата с ниско съдържание на мед, добавена към хронична хипоксия при мишки, засилва техните индивидуални ефекти и комбинацията от леко белодробно съдово ремоделиране, с капилярно разреждане на RV, предизвиква RV недостатъчност. Ето защо предлагаме да се изследва ефектът от диета с ниско съдържание на мед в миши модел на хронична хипоксия върху функцията на дясната камера.

Материали и методи

Животни

Всички боравене с животни и процедури са одобрени от етичната комисия за хуманно отношение към животните в университета в Маастрихт и са в съответствие с правителствените насоки.

Общо 48 мъжки мишки C57BL/6 бяха използвани на 6-седмична възраст в началото на експеримента. Мишките бяха настанени при стайна температура (20 ° С) и поставени в 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Храната и водата бяха достъпни ad libitum; консумацията на храна се наблюдава и е сходна за всичките четири експериментални групи, поради което храненето по двойки се счита за ненужно през целия експеримент. Мишките получават или диета с изчерпване на мед (Harlan Teklad, TD 80388) или нормална диета с чау (Harlan Teklad LM-485).

При хипоксия животните се поставят в запечатана камера (n = 12 на експериментална група); вентилатор, циркулиращ въздух в камерата. Концентрацията на O2 се поддържа на 10% чрез контролиране на скоростта на притока на N2. Преди да поддържат мишките с 10% O2, им беше позволено да се приспособят към заобикалящата ги среда в продължение на 24 часа, за да минимизират стреса и нивата на O2 постепенно бяха намалени до 10% за допълнителен период от 72 часа. Котилите служеха за контрол в групата на нормоксия и бяха държани на въздух в стаята (21% O2); вентилатор осигуряваше правилна циркулация на въздуха в камерата. Камерите бяха отпечатани за по-малко от 15 минути на ден, за да попълнят храната, да почистят клетките и да проверят вентилаторите.

Ехокардиография

Мишките се анестезират с изофлуран (средно 1,5% в кислород), обръсват се и се оставят да дишат спонтанно през носен конус. Неинвазивните, ехокардиографски параметри бяха измерени с помощта на цифрова сърдечна ултразвукова платформа (Vevo 2100, VisualSonics); за сърдечни параметри преобразувателят се прилага парастернално към обръснатата гръдна стена и измерванията се извършват, както е описано по-горе [33].

Мишките бяха обезболени с използване на изофлуран. Телесната температура се наблюдава с помощта на ректална температурна сонда и мишките се поставят под одеяло с топла вода. Освен това честотата на дишането се наблюдава непрекъснато. ЯМР се извършва с помощта на 7 Tesla Bruker Biospec 70/30 USR (Bruker Biospin, Ettlingen, Германия).

Дясната камера е измерена с помощта на Intragate последователност, с полезрение 25,6 × 25,6 mm, матрицата е 256 × 256, TE 3 ms, TR, 60 ms, 7 среза. Киното, изчислено от Intragate последователността, се състои от 15 кадъра. Всички изображения бяха анализирани в OsiriX (Dicom viewer, версия 3.5, Pixmeo, Женева, Швейцария). Крайните диастолични и крайно-систоличните обеми на RV се анализират, като се използват многослойни киноизображения с къса ос на цялата дясна камера. Фракцията на изтласкване на RV се изчислява като (RVEDV-RVESV)/​​RVEDV * 100.

Оценка на хипертрофия на RV

Сърцето беше дисецирано и двете предсърдия, аортата и белодробният ствол бяха отстранени. Дясната камера е отделена от лявата камера и вентрикуларната преграда. Хипертрофия на дясната камера се изразява с помощта на индекса на Фултън; съотношението на теглото на дяснокамерната стена към лявокамерната стена и вентрикуларната преграда (RV/LV + S).

Хистология, имунохистохимия и имунофлуоресценция

Сърдечни и белодробни образци бяха фиксирани и изчистени от кръв чрез перфузия с 3.8% параформалдехид и впоследствие вградени в парафин. Тканевите срезове (4 µm) се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) за рутинна хистологична аналзиса или с пикро-Сириус червено за визуализиране на отлагането на колаген. В допълнение, маркиран с FITC пшеничен зародиш-аглутинин (WGA) се използва за визуализиране и количествено определяне на площта на напречното сечение на клетките; капилярната плътност е визуализирана и количествено определена с помощта на лектиново петно ​​от Griffonia simplicifolia agglutin-I (GS-I).

Слайдовете бяха визуализирани и изобразени с помощта на Zeiss Axioskop 2Plus с AxioCamHRc.

Индексът на Фултън се използва като индекс за хипертрофия на RV и се изчислява като съотношението на теглото на RV без стена над преградата плюс теглото на свободната стена на лявата камера.

PCR в реално време

Грундовете са проектирани за откриване на транскрипти за nppa (NM_008725, 5′-TCTTCCTCGTCTTGGCCTTT, 5′-CCAGGTGGTCTAGCAGGTTC), nppb (NM_008726, 5′-TGGGAGGTCACTCCTGCGCGTAGGTCGTCGTCGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTG GGAAGCATA), myh7 (NM_080728, 5′-CGGACCTTGGAAGACCAGAT, 5′-GACAGC TCCCCATTCTCTGT) и rcan1.4 (NM_019466, 5′-GCTTGACTGAGAGAGCGAGTC, 5′-CCACACAAGCACACAG.

РНК се изолира от тъкан, използвайки TRIzol реагент (Invitrogen). РНК (1 ug) от сърдечна тъкан на дясна камера на мишка беше обратно транскрибирана, използвайки Superscript II обратна транскриптаза (Invitrogen). PCR в реално време се извършва на BioRad iCycler (Biorad), използвайки SYBR Green. Количествата на транскриптите бяха сравнени, използвайки метода на относителния Ct, който нормализира количеството на целта до количеството ендогенен контрол (L7) спрямо контролната проба и се дава чрез 2 − ΔΔCt.

Статистически анализ

Резултатите са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (напр.). Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуер Prism (GraphPad Software) и се състоеше от ANOVA, последван от пост-тест на Tukey, когато групови разлики бяха открити на ниво 5% значимост, или t-тест на Student при сравняване на две групи. Разликите се считат за значими, когато P Фигура 1. Хроничната хипоксия води до увеличаване на индекса на Фултън.

а) Експериментални групи. (б) Дизайн на проучването. (в) Представителни изображения на цели сърца (горни панели), оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) 4-камерни парафинови секции (втори панел), хистологични раздели на свободна дясна вентрикуларна стена с голямо увеличение (трети панели), сириус с червено оцветени с голямо увеличение свободни дяснокамерни стенни секции (долни панели. Сравняват се следните групи: нормоксия при нормална диета с чау (N/Cu +), нормоксия при диета с изчерпване на мед (N/Cu-), хипоксия при диета с нормален чау (H/Cu +) и хипоксия върху диета с изчерпване на мед (H/Cu-). (d) Сърдечно тегло, коригирано за телесно тегло в грамове на грам. (n = 9) * P Фигура 2. Хроничната хипоксия предизвиква намаляване на фракцията на изтласкване на дясната камера.