Редактирано от Дейвид Б. Уейк, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, и одобрено на 22 януари 2020 г. (получено за преглед на 31 октомври 2019 г.)

промяна

Значимост

Животните, защитени от изолирани токсини, трябва да използват алтернативен източник на защитни химикали, когато се промени промяна в диетата. Змиите от рода Rhabdophis притежават защитни жлези, които съхраняват мощни защитни токсини, известни като буфадиенолиди. Родовата плячка на Рабдофис се състои от земноводни анурани, включително жаби (Bufonidae), които са източникът на секвестирани буфадиенолиди. Членовете на производна клада от Rhabdophis консумират нетоксични земни червеи като основна плячка, но техните покривни жлези все още съдържат буфадиенолиди. Ние демонстрираме, че змиите от кладата, която яде червеи, получават своите защитни токсини предимно чрез консумация на ларви светулки. Нашата констатация представлява забележителен еволюционен пример, в който преминаването от гръбначна към безгръбначна плячка осигурява същия химичен клас на изолирани отбранителни токсини.

Резюме

Химически защитените животни могат или да синтезират токсините си от нетоксични прекурсори, или да ги набавят от външен източник и да ги съхраняват за преразпределение срещу хищник. Такива изолирани защити са широко разпространени сред безгръбначните, но са по-малко известни сред гръбначните (1). Японската натрицинова колубридна змия Rhabdophis tigrinus изолира мощни кардиотонични стероиди, известни като буфадиенолиди (BD) от жаби (Bufonidae), консумирани като плячка (2 ⇓ –4). Краставите жаби синтезират BD от холестерол в техните покривни жлези (5), а R. tigrinus поглъща токсините и ги съхранява в структури, известни като нухални жлези (NGs), разположени в гръбната кожа на врата. Когато змията е нападната, NG се разкъсват и освобождават вредните токсини, изолирани от краставите жаби. Няколко други вида азиатски змии притежават или NG, или подобни структури, които се простират по цялата дължина на тялото (известни като нухо-дорзални жлези, NDG). Неотдавнашно проучване потвърди, че всички видове змии, които притежават NG или NDGs, принадлежат към монофилетична линия на Natricinae и сега всички са поставени в рода Rhabdophis (6). По-нататък филогенията разкрива, че базовите видове на Rhabdophis плячкат на земноводни от ануран, които по този начин изглежда съставляват родовата диета от този род (фиг. 1В).

Буфадиенолидите са клас кардиотонични стероиди, отличаващи се с наличието на шестчленен лактонов пръстен в позицията C-17 върху стероидното ядро ​​(приложение SI, фиг. S1 и фиг. 2), за разлика от петчленния пръстен, който характеризира по-познатите карденолидни съединения, като дигоксин и уабаин. Както BD, така и карденолидите упражняват своите фармакологични ефекти чрез инхибиране на Na +/K + -ATPase (NKA), повсеместен ензим на клетъчната повърхност, който транспортира натриеви йони от клетката и калиеви йони инча. Инхибирането на NKA увеличава и удължава свиването на сърдечния мускул, превръщайки тези съединения в мощни токсини срещу повечето гръбначни хищници. Въпреки това, мутациите, кодиращи устойчиви паралози на NKA, са се развили в различни животински групи (7 ⇓ –9), включително Rhabdophis (10), което им позволява да консумират и в някои случаи да съхраняват кардиотонични стероиди.

Обща йонна хроматограма (TIC) на течността на жлезата от R. pentasupralabialis и структурите на съединения 1 до 4. Основните съединения показват ултравиолетови (UV) спектрални характеристики на буфадиенолидите (lmax 295 nm, в CH3OH/H2O). „I.S.“ = вътрешен стандарт (дигитоксигенин).

В допълнение към жабите, BD се срещат в някои светулки (Lampyridae), в които те могат да бъдат посочени по-специално като луцибуфагини (фиг. 1А) (11, 12). Женските от някои видове светулки (така наречените „femmes fatales“) получават своите BD чрез агресивна имитация, примамване и консумиране на мъжките от химически защитени видове, като по този начин придобиват токсини чрез секвестиране (13). Други светулки могат да синтезират своите BD, но биосинтетичният път при светулките не е идентифициран (14). Краставите жаби и светулките са единствените животни, които в момента са известни или се предполага, че синтезират тези съединения.

Тук ние съобщаваме за забележителен случай, в който производна клада от Рабдофис е изместила основната си диета от земноводни към земни червеи и, едновременно с тази диетична промяна, е преместила източника на своите изолирани отбранителни токсини от жаби към светулки. Нашите данни показват, че еволюционната промяна в диетата от гръбначна към безгръбначна плячка е била придружена от придобиването на същия клас изолирани съединения от нов източник на плячка, като по този начин се запазва химическата защита на хищника. Въпреки че някои фитофагови насекоми и много отровни жаби консумират разнообразна диета и секвестиращи съединения от различни растения или членестоноги, съответно (15, 16), докладваната драматична промяна от гръбначен към членестоног източник от същия клас защитни съединения представлява необикновено еволюционно събитие.

Резултати и дискусия

В рамките на Rhabdophis съществува производна клада, R. nuchalis Group, която съдържа R. nuchalis, Rhabdophis pentasupralabialis и Rhabdophis leonardi. Тази видова група е претърпяла промяна от диетата на предците на земноводните към диета, доминирана от земни червеи (фиг. 1Б) (6). Членовете на групата R. nuchalis са по-малки от другите рабдофи, с по-малко драматично оцветяване и по-тясна глава. Последната характеристика обикновено отразява относително по-къси квадратни кости (17), състояние, типично за змии, които консумират продълговата плячка, като земните червеи. Ограничената литература за диетата на групата R. nuchalis предполага, че тези змии ядат главно глисти и охлюви (18). Ние потвърдихме, че диетата на дивата R. pentasupralabialis се състои предимно от глисти. Изследването на съдържанието на червата на 28 запазени екземпляра разкрива 12 с останки от плячка, осем от които включват една или две дъждовни червеи (приложение SI, таблица S1). В лабораторни тестове за хранене, включващи 10 индивида от R. pentasupralabialis, девет са консумирали земни червеи, докато никой не е приемал жаби-раниди, а само един е консумирал жаба. Стандартните тестове за химически предпочитания на поглъщащи наивни люпили показват подобна тенденция: силно химическо предпочитание за земни червеи, средно предпочитание за жаби и без значително предпочитание за жаби с раниди (приложение SI, фиг. S2 и таблица S2).

Анализирахме течност от нухо-дорзалните жлези на R. pentasupralabialis и установихме, че течността съдържа BD. Не е известно обаче, че земните червеи произвеждат BD; тествахме няколко таксона и не успяхме да открием токсините. По този начин, земните червеи са много малко вероятно източник на BDs в змиите. От NDG течността на R. pentasupralabialis идентифицирахме и структурно охарактеризирахме четири буфадиенолида, за които преди това не се съобщава от Rhabdophis (Фиг. 2 и 3). Съединения 1 (448) и 4 (564) обаче преди това са били изолирани от северноамериканска светулка, Lucidota atra (19). Другите две, съединения 2 (490A) и 3 (490B), са нови BD, и двете от които също открихме в лампиоидите на светулката Diaphanes от Тайван. Важно е, че буфадиенолид ксилозиди, като съединение 564, по-рано са докладвани сред животни само от светулки (фиг. 1А) (12, 19), като допълнително подкрепят хипотезата, че R. pentasupralabialis съхранява буфадиенолиди от светулки. Също така открихме всеки от тези четири BD от поне един образец на R. nuchalis и R. leonardi (фиг. 3), и двамата членове на групата R. nuchalis. Тези открития показват, че преминаването на източника на токсин от крастави жаби към светулки е производна характеристика на линията, която яде червеи.

Седем буфадиенолиди, идентифицирани от R. pentasupralabialis и/или R. tigrinus въз основа на ЯМР, и наблюдаваният им процент при три вида от групата R. nuchalis (R. pentasupralabialis, R. nuchalis и R. leonardi). [M + H] + йони, време на задържане и A-B пръстенна стереохимия са показани за всяко съединение. Наблюдаваните честоти се основават на NMR или HPLC анализ. Цифрите в скоби след научните имена са с размер на извадката. Буфадиенолидите, идентифицирани от R. pentasupralabialis, са заобиколени от син ромб, а тези от R. tigrinus са заобиколени от червен ромб.

Хипотезата, че тези четири съединения са изолирани от светулки, се подкрепя допълнително от стереохимията на съединенията. Всички буфадиенолиди, идентифицирани от R. pentasupralabialis, притежават транс-кондензирана A-B пръстенна система. BD на светулките включват съединения с кондензирани пръстени или цис, но всички BD от жаби (и тези, изолирани от R. tigrinus от жаби) имат цис-кондензирана AB пръстенна система (фиг. 1А) (2, 20 ⇓ ⇓ –23). От карденолидите, които са насочени към един и същ клетъчно-повърхностен протеин (NKA), е известно, че и двата типа A-B пръстенна връзка са токсични, но съединенията с cis връзка имат малко по-силен фармакологичен ефект от тези с транс-връзка (24). Също така е важно, че съединения 2 и 3 са ацетилирани съответно в позициите С-2 и С-3. Известно е, че някои BD на светулка се ацетилират при C-2, C-3, C-4 или C-16, докато токсините от жаби са известни като ацетилирани само при C-16, ако изобщо са (фиг. 1А) (25 ).

Заключенията от нашите химически проучвания се подкрепят допълнително от изследване на диетата и предпочитанията за поведение на плячката на R. pentasupralabialis. В допълнение към земните червеи открихме осем ларви на лампиринови светулки (Diaphanes sp.) От стомаха и/или червата на пет от 12-те запазени змии със съдържание на червата (приложение SI, таблица S1). При отделни лабораторни тестове за хранене, поне три от петте R. pentasupralabialis доброволно са консумирали ларви на свързана лампиринова светулка (Pyrocoelia sp.). Взети заедно, нашите химични, диетични, хранителни и поведенчески изследвания показват, че R. pentasupralabialis се храни предимно с земни червеи, но също така консумира ларви на лампиринови светулки и изолира своите буфадиенолиди от тези насекоми (фиг. 1Б). Химичните, диетичните и поведенческите изследвания също предполагат, че жабите се запазват като второстепенен компонент на диетата и малък източник на BD.

Сред видовете рабдофис промяната в основната диета, от жаби към глисти, не е необичайна. Земните червеи са многобройни, широко разпространени и с продълговата форма, което ги прави достъпни за змии с дори ограничен отвор. Следователно те се ядат от много видове змии, принадлежащи към различни родове (34). Всъщност някои други натринови родове, като Thamnophis (Северна Америка) и Hebius (Азия), включват видове, които консумират земни червеи, често в допълнение към жабите и друга плячка (35, 36). За разлика от земните червеи обаче, насекоми или други членестоноги се консумират от относително малко видове змии алетинофиди (17, 37). По този начин, промяната в токсичната плячка, наблюдавана в рамките на Rhabdophis, от родовия източник на буфадиенолиди (жаби) към филогенетично отдалечен източник на същия клас токсини (светулки) (фиг. 1Б), е забележителна.

Материали и методи

Проучване на видове.

R. pentasupralabialis е средно голяма натрицинова змия, разпространена в провинциите Съчуан и Юнан, Китай. Първоначално е описан като подвид на R. nuchalis (40) и впоследствие е издигнат до пълен вид от Zhao (41). Mori et al. (42) демонстрира присъствието на нухо-дорзални жлези в R. pentasupralabialis, както също е описано за R. nuchalis от Smith (43). Налични са допълнителни химични данни за R. nuchalis и R. leonardi, които са членове на групата R. nuchalis, и за Rhabdophis formosanus, Rhabdophis himalayanus, Rhabdophis lateralis, Rhabdophis plumbicolor, Rhabdophis subminiatus, Rhabdophis R. tinhonis, Rhabdophis R., всички от които имат нухални или нухо-дорзални жлези (виж допълнение SI, допълнителни данни за размерите на пробите и местонахождението).

Тестове за предпочитане на плячка и хранене.

За теста за хранене на светулка използвахме пет възрастни R. pentasupralabialis (дължина на муцуната, 485 до 605 mm, двама мъже и три жени), събрани в Xingou, Ya'an, провинция Съчуан, Китай през август 2016 г. Всяка змия беше държана в пластмасова клетка (около 40 × 60 × 40 см) в лаборатория в Националния университет Лешан, при температура на въздуха 25 ° C, влажност от 70 до 80% и 14:10 d: нощен цикъл на светлината (светлина: 0600 до 2000 ч). Изпитванията за хранене на светулки бяха проведени от края на август до началото на септември и не беше предложена храна за поне 1 седмица преди изпитанията. Въведохме три ларви от Pyrocoelia sp. (събрани в провинция Дзянси) в клетката и ги оставили за 72 часа. Видеокамера (HIKVISION, DS-7908N-E4), оборудвана с инфрачервено осветление, беше поставена над клетката, за да запише змията за последващ анализ.

На 5 септември 2014 г. беше проведен тест за химическа реакция, използващ 19 поглъщащи наивни люпила, за да се определи дали R. pentasupralabialis проявява вродено предпочитание към земните червеи и/или жабите. Подготовката и представянето на химични стимули се следват добре установен протокол за тестване на химическа дискриминация от вомероназалния орган в Squamata (45, 46). На змиите бяха представени памучни тампони, носещи повърхностни стимули от потенциална плячка. Животните, използвани за химически стимули, включват жаби (Fejervarya fujianensis, Ranidae); крастави жаби (B. gargarizans, Bufonidae); гущери (Gekko subpalmatus, Gekkonidae); и два вида земни червеи (Amynthas aspergillum, Megascolectidae и E. andrei, Lumbricidae). Тези видове са избрани, защото те или техните близки роднини са симпатици на R. pentasupralabialis или други членове на групата R. nuchalis. Ларвите на лампиди на светулки не са били налични за използване в този тест. За контрол се използват дестилирана вода и одеколон (Shower Fresh, Ocean Citrus, Mandom; разредени до 10% с дестилирана вода), водата като разтворител за миризми на плячка и одеколон като откриваема, но биологично без значение миризма.

Ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) -спектроскопски анализ.

ЯМР спектрите се измерват с Bruker AV-400 III спектрометър (400 MHz), като се използва тетраметилсилан като вътрешен стандарт. Всяка проба беше разтворена в CD3OD и 1 Н, 13 ° С, водородно-водородна корелационна спектроскопия (HH COZY), хетероядрена едноквантова корелация (HSQC), хетероядрена кохерентност с многобройни връзки (HMBC) и ядрен свръхаузер ефект и обменна спектроскопия ( NOESY) бяха получени спектри. Данните за 1 H-NMR се записват, както следва: химично изместване (δ, ppm), множественост (s, синглет; d, дублет; t, триплет; q, квартет; m, мултиплет; br, широко), интегриране и свързване постоянна (Hz).

Наличност на данни.

Всички данни се съдържат в основния текст и подкрепяща информация, с изключение на данните за молекулното тегло на токсини от змии и светулки, които ще бъдат предоставени от съответния автор при разумна заявка.