Palladio Biosciences Inc.

рецептора

12 Penns Trail Unit A

Нютаун, Пенсилвания 18940 (САЩ)

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Заден план: Инхибирането на рецептора на вазопресин V2 е клинично валидиран механизъм на действие при лечението на автозомно доминиращо поликистозно бъбречно заболяване (ADPKD). В това проучване ефектът на ликсиваптан, мощен, селективен антагонист на вазопресин V2, е оценен при PCK плъхове, валидиран животински модел на ПКД. Методи: Четириседмични PCK плъхове са хранени с гризачи с 0,5% ликсиваптан (ниска доза) или 1% ликсиваптан (висока доза) или само с чау (контрол) в продължение на 8 седмици. Изходът на урина е измерен на 7 и 10 седмична възраст. Животните бяха убити на 12-седмична възраст; бъбреците и черния дроб бяха събрани, претеглени и анализирани за циклични нива на аденозин 3 ', 5′-монофосфат (сАМР) и кистозна тежест и фиброза; измерват се серумен креатинин и натрий. Резултати: В съответствие с развитието на поликистозен бъбречен фенотип, контролните PCK плъхове показват увеличени бъбреци, обширно образуване на кисти и ранни признаци на повишаване на серумния креатинин на 12-седмична възраст. В сравнение с контролите, PCK плъховете, лекувани с ниски дози ликсиваптан, показват 26% намаление в% бъбречно тегло/телесно тегло (стр

Въведение

Автозомно доминиращо поликистозно бъбречно заболяване (ADPKD) е наследствено генетично заболяване, характеризиращо се с образуване и увеличаване на пълни с течност кисти в бъбреците, черния дроб и други органи, което води до прогресивна загуба на бъбречна функция [1]. ADPKD е резултат от мутации на загуба на функция в гените на полицистин (PKD) 1 или 2, които нарушават нормалния диференциран фенотип на бъбречния тубулен епител, което води до повишаване на вътреклетъчния цикличен аденозин 3 ', 5'-монофосфат (cAMP) и в резултат на което се увеличава клетъчната пролиферация и образуването на кисти [2]. Растежът на киста измества и уврежда нормалната бъбречна тъкан, което води до намаляване на нефронната функция.

ADPKD е едно от най-често срещаните генетични заболявания, с прогнозна честота до 1 на 500–1000 [1]. Смята се, че ще засегне 12,5 милиона души по целия свят. ADPKD представлява 5–10% от крайните стадии на бъбречно заболяване, като приблизително 50% от пациентите с ADPKD развиват краен стадий на бъбречно заболяване до 60-годишна възраст. Това прави ADPKD четвъртата водеща причина за бъбречна недостатъчност.

Моделът PCK плъх е ортологичен модел на човешки PKD, причинен от сплайсинг мутация в Pkhd1 ген и е утвърден и широко използван модел в областта на изследванията на ПКД [9, 10]. Характеризира се с прогресивна цистогенеза, повишени нива на бъбречен сАМР и увреждане на бъбречната функция, които са фенотипно подобни на ADPKD при хора. Важно е, че беше установено, че антагонистът на вазопресиновия рецептор толваптан е ефективен в модела на PCK плъхове [11], утвърждавайки модела като възможен предиктор за ефикасност при хората.

Целта на настоящото проучване беше да се определят ефектите на ликсиваптан в модела на PCK при плъхове с особен акцент върху крайните точки за проява на заболяването (тегло на бъбреците като процент от общото телесно тегло, тежест на кистата, бъбречни нива на cAMP и серумен креатинин), както и фармакодинамични крайни точки (отделяне на урина и концентрация на серумен електролит). В допълнение към бъбречните прояви, по-голямата част от пациентите с ADPKD развиват и чернодробни кисти и фиброза; следователно, ние също изследвахме дали ликсиваптан може да подобри чернодробната патология при PCK плъхове.

Материали и методи

Животни

Институционалната комисия за грижи и използване на животните одобри всички експериментални протоколи, описани тук. Плъховете PCK (щам Sprague-Dawley), използвани в това проучване, се поддържат в съоръженията за животни на Департамента по ветеринарна медицина на клиниката Mayo (Рочестър, MN, САЩ). Животните бяха настанени по 2 мъжки или 3 женски на клетка и хранени със смляна чау-чау в либитум (Purina Mills, Richmond, IN, USA).

Дизайн и процедури на изследването

На 4-седмична възраст PCK плъховете бяха разделени на 3 групи: една контролна група и 2 третирани групи от по 20 животни всяка (10 женски и 10 мъжки). Животните са получавали или смлян чау от гризачи, съдържащ 0,5% ликсиваптан (група с ниски дози), 1% ликсиваптан (група с високи дози), или чау от гризачи без ликсиваптан (контролна група) в продължение на 8 седмици. Фармакокинетичните експерименти показват, че тези перорални дози ликсиваптан дават експозиция, сравнима с прилагането на приблизително 30–100 mg/kg ликсиваптан чрез орален сондаж (непубликувани данни). Диетите се приготвят чрез разтваряне на ликсиваптан в DMSO при концентрация от 0,5 g/ml и получения разтвор на ликсиваптан се смесва с твърдата диета (2016CM Harlan Teklad Global Rodent Diet®, Harlan Teklad, Inc., Indianapolis, IN, USA) за 1 h с помощта на кухненски робот с голям капацитет. Диетата от контролната група съдържа DMSO, но няма лекарство. Всички хранителни препарати се приготвяха пресни ежеседмично в лабораторията за безопасност на продуктите в Монро, Ню Джърси, САЩ, и се съхраняваха на тъмно до готовност за употреба. Храната се предоставя на базата на 5 g фураж на 100 g телесно тегло на животното. Приемът на храна и теглото на животните се наблюдават ежеседмично.

Животните бяха поставени в метаболитни клетки на 7 и 10 седмична възраст за измерване на 24-часови отделяния на урина. На 12-седмична възраст животните се претеглят и убиват чрез анестезия с интраперитонеален кетамин (90 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg). Кръвта се събира чрез сърдечна пункция за определяне на нивата на плазмените електролити, креатинин и урея. Десният бъбрек и част от черния дроб се поставят в предварително претеглени флакони, съдържащи 10% формалдехид във фосфатен буфер, рН 7,4. Тъканите са вградени в парафин за хистологични изследвания. Лявите бъбреци се замразяват бързо в течен азот за определяне на сАМР.

Бъбреци и черен дроб Хистоморфометричен анализ и имунохистология

Петмикронни напречни тъканни участъци на бъбреците (включително кората, медулата и папилата) и черния дроб бяха оцветени с хематоксилин-еозин, трихром на Masson’s и пикросириус червено. За измерване на обемите на кисти са използвани цели напречни тъканни участъци с оцветяване с хематоксилин-еозин. Picrosirius червено оцветяване на колагенови влакна се използва за анализ на фиброза, а цели срезове се използват за чернодробна фиброза. Всички тъканни срезове бяха оцветени с пикросириус червено в една партида, за да се избегне вариабилността на оцветяването от партида в партида. За бъбречна фиброза бяха събрани последователни изображения, използвайки 10x обектив, като се движеха по централната линия на всеки участък от единия край на наличната кора до другия, без да се припокриват, за да се получи обективна проба. Бъбречна медула не е измерена. За чернодробна фиброза бяха анализирани цели разрези.

Анализът на изображенията със светлинна микроскопия беше извършен с помощта на софтуерната система NIS-Elements AR (Nikon, Elgin, IL, USA), която включва светлинен микроскоп с цветен цифров фотоапарат (Nikon DS-Ri1) и компютър, съвместим с Pentium IBM (HP Z420). Оцветените секции бяха визуализирани под микроскоп Nikon и цифровите изображения бяха получени с помощта на Nikon цифрова камера с висока разделителна способност. Наблюдателят може да приложи интерактивно техники за подобряване за по-добро дефиниране на заинтересованите структури или да изключи полета, твърде повредени, за да бъдат анализирани. Визуално бяха изключени вените и жлъчните пътища. За да се изчисли обемът на бъбречна или чернодробна киста или фиброза, се прилага оцветен праг на ниво, което отделя обектите от фона им. Резултатите от кистата на бъбреците/черния дроб и фиброзата бяха изразени като процент от площта с кисти или фиброза върху общата анализирана площ.

cAMP Съдържание на цели бъбреци

Замразените бъбреци се претеглят и смилат до фин прах под течен азот с помощта на хоросан от неръждаема стомана и се хомогенизират в 10 обема 0,1 М НС1 при стайна температура. Общата концентрация на протеин се измерва с помощта на BCA Protein Assay Kit (Pierce, IL, USA). След центрофугиране при 600 х g в продължение на 10 минути при стайна температура, супернатантът се разрежда допълнително в 0,1 М HCI и се пуска директно в cAMP анализа или се съхранява замразен за по-късен анализ. Съдържанието на cAMP беше оценено чрез Direct cAMP ELISA комплект, съгласно инструкциите на производителя (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA). Пробите бяха обработени в три екземпляра. Резултатите са изразени в pmol/mg протеин.

Други анализи

Кръв, събрана на 12-та седмица, се използва за измерване на плазмен креатинин, урея, натрий и калий. Плазменият креатинин и урея се измерват с помощта на наборите за анализ на креатинина и уреята Quantichrome (Bioassay Systems, Hayward, CA, USA). Измерванията на плазмата на натрий и калий бяха извършени с помощта на pHOx Ultra Comprehensive Critical Care Analyzer (Nova Biomedical, Waltham, MA, USA).

Статистически анализ

Данните са изразени като средни стойности ± SD. Сравненията между групите бяха анализирани с помощта на 1- или двустранен дисперсионен анализ с сравнения с най-малко значими разлики на средствата или на Student т тест, според случая. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуера PRISM (La Jolla, CA, USA). стр 0,05), 25% подобрение в резултата за киста (стр 0,05; Фиг. 1). Статистическото разделяне между групата с високи дози ликсиваптан и контролната група е повлияно отрицателно от наличието на 3 отклонения в групата с високи дози, които показват съпътстващи повишени съотношения на тегло на органи спрямо телесно тегло за бъбреци, сърце, черен дроб и/или далак . Значението на тази находка е неизвестно. Премахването на тези 3 отклонения от групата с високи дози и едно подобно отклонение от контролната група доведе до значителна разлика между групата с високи дози и контролната група за% бъбречно тегло/телесно тегло (съответно 1,3 срещу 1,6%; стр 0,05; Маса 1).

Повишеният вътреклетъчен сАМР играе ключова роля в клетъчните процеси, които водят до развитието на PKD фенотип [13]. Съответно, бъбречните нива на cAMP са повишени при PCK плъхове в сравнение с дивия тип животни и съществува положителна корелация между тъканните нива на cAMP и тежестта на PKD [3]. Лечението на PCK плъхове с ниски дози ликсиваптан доведе до 23% намаляване на нивата на сАМР в сравнение с контролните животни (стр 0,05) и резултат от фиброза (20,6% намаление; стр> 0,05). Обратно, групата с високи дози ликсиваптан не се отделя от контрола за чернодробните параметри (данните не са показани).

Фиг. 2.

Ефект на ликсиваптан върху морфологията на черния дроб. а Представителни хистологични изображения на напречни чернодробни участъци от PCK плъхове, лекувани с ниска доза ликсиваптан в сравнение с контролите. б Ефект на ликсиваптан върху% чернодробно тегло/телесно тегло, резултат от чернодробна киста и резултат от чернодробна фиброза. Данните са средни ± SD. *** стр