R&D център, BIONEER Co., Daejeon, Южна Корея

R&D център, BIONEER Co., Daejeon, Южна Корея

R&D център, BIONEER Co., Daejeon, Южна Корея

R&D център, BIONEER Co., Daejeon, Южна Корея

R&D център, BIONEER Co., Daejeon, Южна Корея

R&D център, BIONEER Co., Daejeon, Южна Корея

Резюме

Цели: За да се изследва ефектът от Lactobacillus gasseri BNR17, изолиран от човешко майчино мляко върху кръвната захар и телесното тегло при диабетни животни тип 2.

Методи и резултати: db/db мишките бяха разделени на една контролна група и пет групи проби; пробните групи са получавали BNR17 (10 7, 10 8, 10 9 и 10 10 CFU) или розиглитазон (8 mg kg -1) перорално два пъти дневно в продължение на 12 седмици. Групите BNR17 са имали дозозависимо намаляване на храната, приема на вода и количеството екскременти. Загуба на телесно тегло не се наблюдава при групите BNR17. Нивата на кръвната захар на гладно и след хранене след 2 часа са значително по-ниски в групата BNR17 (10 10 CFU) в сравнение с контролната група. HbA1c намалява в групата BNR17, въпреки че не е статистически значим. По време на оралния тест за глюкозен толеранс, групите BNR17 показаха зависимо от дозата подобрение в чувствителността към глюкоза.

Заключения: Lactobacillus gasseri BNR17 има потискащ ефект върху нивата на кръвната захар и подобрява симптомите на диабет в db/db мишки.

Значение и въздействие на проучването: Понижаващите кръвната захар млечнокисели бактерии се очаква да бъдат полезни като терапевтично средство за лечение на диабет тип 2 при хората.

Въведение

Увеличението на нивата на затлъстяване, поради поведенчески и културни фактори, като прекомерен прием на сладки и богати на мазнини храни и недостатъчно физическо натоварване, се очаква да увеличи значително честотата на диабет тип 2. Диабет тип 2 е група от метаболитни заболявания, характеризиращи се с хипергликемия в резултат на дефекти в секрецията на инсулин, действието на инсулин и повишеното производство на чернодробна глюкоза. Хроничната хипергликемия на диабет тип 2 също е свързана с дългосрочни увреждания, дисфункция и отказ на различни органи, особено на очите, бъбреците, нервите, сърцето и кръвоносните съдове (Schuster и Duvuuri 2002).

Има няколко одобрени нови лекарства за лечение на диабет тип 2. В момента има пет класа перорални антидиабетни средства: сулфонилурейни продукти, меглитиниди, инхибитори на алфа-глюкозидазата, тиазолидиндиони и бигуаниди. Освен това има няколко вида инсулин и инсулинови аналози за лечение на хипергликемия (McCormick and Quinn 2002). Използването на тези лекарства обаче има редица ограничения, като странични ефекти и вторична недостатъчност.

Много усилия бяха насочени към разработването на традиционни лекарства (женшен, зелен чай, плодове от черница, копринени буби и екстракти от билки и др.) Като допълващо или алтернативно лечение на диабет, тъй като тези природни продукти се приемат от години за различни заболявания без странични ефекти или токсичност (Kim и др. 1996; Xie и др. 2002; Цунеки и др. 2004; Манг и др. 2006; Лий и др. 2007). През последните години се съобщава, че пробиотиците [млечнокисели бактерии (LAB)] имат ефикасност, свързана с прогресирането на диабета (Matsuzaki и др. 1997a, b; Табучи и др. 2003; Мога ли и др. 2007; Ядав и др. 2007). В тези проучвания LAB предотвратява или забавя появата на диабет в различни експериментални модели, включително индуцирани от химикали или диети и генетично мутирани животни (db/db мишки). Има обаче малко проучвания върху LAB като лечение на диабет, въпреки доказателствата, които показват, че те имат потенциал да намалят честотата на диабета (Matsuzaki и др. 1997a, b; Табучи и др. 2003; Мога ли и др. 2007).

Lactobacillus gasseri BNR17 преди това е изолиран от човешкото кърма и е оценен за неговите пробиотични свойства, включително толерантност към киселина/жлъчка, прилепване към чревните клетки и производство на антимикробни съединения в нашата лаборатория. В това проучване изследвахме дали BNR17 влияе върху нивата на кръвната глюкоза в C57BL/KS/J db/db мишки. Този модел на диабетна мишка е създаден от спонтанна мутация в гена на db на диабет. The db/db мишките имат характеристики, подобни на хората с диабет тип 2, включително затлъстяване, хипергликемия и екстремна инсулинова резистентност (Chang и др. 2006). Тук съобщаваме, че BNR17 намалява кръвната захар на db/db мишки и подобрява различни симптоми на диабет, включително полидипсия, хиперфазия и полиурия.

Материали и методи

Приготвяне на бактериални суспензии

Lactobacillus gasseri BNR17, използван в това проучване, е изолиран от човешката кърма в нашата лаборатория. Lactobacillus gasseri Проби от BNR17 за администриране на животни бяха приготвени чрез суспендиране на лиофилизиран бактериален прах във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Като помощни вещества за лиофилизиране на BNR17 са използвани обезмаслено мляко, трехалоза и фруктоолигозахаридна смес [2: 1: 1 (w/v)].

Животни и експериментално проучване

Преди започването на експеримента (седмица 0) и на седмици 3, 6, 9 и 12 бяха проведени тестове за орален глюкозен толеранс (OGTT). Преди всеки тест, мишките са гладували в продължение на 16 часа и след това се измерва кръвната захар (време = 0). Приготвя се глюкозен разтвор в концентрация от 1 g kg -1 телесно тегло и след това се прилага на мишките. Стойностите на кръвната глюкоза се определят на всеки 30 минути за период от 2 часа.

Концентрациите на кръвната глюкоза се анализират с глюкомер (Allmedicus, Anyang, Южна Корея). HbA1c е измерен с четец на Nycocard (Nycomed Pharma As. Осло, Норвегия; нормален диапазон 4,5–5,7%).

Експерименталните данни бяха представени като средства със стандартни грешки. Статистическата значимост на разликите е анализирана от еднопосочна anova (SPSSWIN 12.0 софтуер; SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). P

Резултати

Както е показано на фиг. 1, телесното тегло в контролната група се увеличава за 8 седмици, но след това намалява до края на експеримента. Тази тенденция не се наблюдава при останалите групи. Телесното тегло на останалите групи има тенденция да се увеличава през експерименталния период; обаче телесното тегло на животните, хранени с розиглитазон, продължава да нараства, докато нарастването на телесното тегло на групите BNR17 е бавно или е спряло след 8 седмица.

gasseri

Промяна в телесното тегло на db/db администрирани мишки Lactobacillus gasseri BNR17 за 12 седмици. *P

В таблица 1 средният седмичен прием на храна в продължение на 12 седмици в групата на розиглитазон е най-нисък сред експерименталните групи (P Таблица 1. Средни стойности на наддаване на телесно тегло, прием на вода и храна и количество екскременти на приложените животни Lactobacillus gasseri BNR17 за 12 седмици

Група Наддаване на телесно тегло (g ден -1) Прием на храна (g ден -1) Прием на вода (ml ден -1) Количество екскременти (g ден -1)
Контрол 0 · 21 ± 0 · 09 6 · 50 ± 0 · 21 17 · 29 ± 1 · 25 13 · 63 ± 0 · 75
Розиглитазон 0 · 32 ± 0 · 03 * 4 · 89 ± 0 · 14 *** 3 · 35 ± 0 · 07 *** 3 · 03 ± 0 · 11 ***
БНР17 (7) 0 · 22 ± 0 · 06 6 · 26 ± 0 · 16 * 13 · 72 ± 1 · 53 *** 11 · 37 ± 1 · 23 ***
БНР17 (8) 0 · 20 ± 0 · 09 6 · 33 ± 0 · 12 14 · 28 ± 0 · 33 *** 11 · 96 ± 0 · 09 **
БНР17 (9) 0 · 25 ± 0 · 08 5 · 85 ± 0 · 38 ** 12 · 07 ± 2 · 67 *** 9 · 91 ± 1 · 86 ***
БНР17 (10) 0 · 25 ± 0 · 07 5 · 44 ± 0 · 39 *** 9 · 11 ± 3 · 49 *** 7 · 18 ± 2 · 48 ***

Промяна в гладно (а) и след хранене 2 часа (б) нива на глюкоза в кръвта на db/db администрирани мишки Lactobacillus gasseri BNR17 за 12 седмици. *P

В края на експеримента нивата на HbA1c на мишки от групата на розиглитазон са значително по-ниски (P Таблица 2. Нива на гликозилиран хемоглобин (HbA1c) на администрирани животни Lactobacillus gasseri BNR17 за 12 седмици

Група HbA1c (%) 0 седмица 6 седмици 12 седмици
Контрол 4 · 70 ± 0 · 52 7 · 86 ± 0 · 60 8 · 70 ± 0 · 61
Розиглитазон 4 · 48 ± 0 · 48 4 · 18 ± 0 · 51 * 4 · 06 ± 0 · 36
БНР17 (7) 4 · 52 ± 0 · 75 7 · 54 ± 0,47 8 · 22 ± 0 · 61
БНР17 (8) 4 · 60 ± 0 · 26 7 · 52 ± 0 · 72 8 · 94 ± 0 · 86
БНР17 (9) 4 · 46 ± 0 · 26 6 · 94 ± 0 · 73 8 · 38 ± 0 · 93
БНР17 (10) 4 · 34 ± 0 · 21 6 · 80 ± 0 · 52 7 · 44 ± 0 · 62

Толеранс към глюкоза през устата db/db администрирани мишки Lactobacillus gasseri BNR17 за 12 седмици. Нивата на кръвната глюкоза се определят на 0, 30, 60, 90 и 120 минути. *P

Дискусия

Ефектът от Лакт. газсери BNR17, който е изолиран от човешко майчино мляко, при диабет тип 2 db/db са изследвани мишки.

По-рано сме оценявали пробиотичните свойства и безопасността на Лакт. газсери БНР17. Жизнеспособни бактериални клетки остават след третиране с киселина (pH 2 · 0, 2 h) и жлъчни соли (0, 3% oxgall, 9 h), което показва, че BNR17 може да устои на суровата стомашно-чревна среда. BNR17 се придържа към клетки Caco ‐ 2 (човешки клетки на дебелото черво), което предполага, че има способността да колонизира човешкия стомашно-чревен тракт. Lactobacillus gasseri BNR17 също проявява антибактериална активност срещу хранителни патогенни бактерии като Ешерихия коли, Listeria monocytogenes, Стафилококус ауреус, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium и Proteus mirabilis. BNR17 е бил резистентен към някои антибиотици, включително гентамицин, канамицин, стрептомицин, бацитрацин, неомицин, налидиксинова киселина, ципрофлоксацин, полимиксин В и триметоприм, но не е бил устойчив на ванкомицин. Животните (SD плъхове), които са били хранени с BNR17 в продължение на 8 седмици, са останали здрави и не са наблюдавани макроскопични промени в мезентериалните лимфни възли, далака, бъбреците или чернодробната морфология, което предполага, че BNR17 има малко или никакви странични ефекти.

Установено е, че BNR17 ефективно намалява нивото на глюкозата в кръвта и подобрява диабетичните симптоми като полидипсия, хиперпазия и полиурия. Загубата на телесно тегло, често наблюдавана при диабетни мишки тип 2, също е предотвратена чрез приложение на BNR17. Използвахме розиглитазон като положителна контрола в сравнение с антидиабетния потенциал на BNR17, тъй като той е основно перорално антидиабетно лекарство, което намалява инсулиновата резистентност чрез активиране на активираните от пероксизома пролифератор рецептори. Прекомерното повишаване на телесното тегло представлява известен сериозен страничен ефект на розиглитазон. Групата на розиглитазон в нашето проучване показва непрекъснато нарастване на телесното тегло през експерименталния период. За разлика от розиглитазон, никоя от дозите BNR17 не води до прекомерно увеличаване на телесното тегло.

Нивата на кръвната захар на гладно и след хранене след 2 часа и OGTT се запазват чрез прилагане на BNR17 по време на експерименталния период. На 6 и 9 седмици стойностите на AUCglucose регистрират значителни намаления в сравнение с контролната група само за групите BNR17 (10), с тенденции към по-ниските дози. Дори ако тези ефекти бавно намаляват на 12 седмици, тези резултати показват, че BNR17 има положителен ефект върху лечението на диабет тип 2.

Прилагането на BNR17 в дози 10 10 CFU понижава стойностите на HbA1c, но това не е статистически значимо. HbA1c е важен фактор, използван за проследяване на дългосрочния баланс на кръвната захар, тъй като отразява броя на молекулите на глюкозата, прикрепени към хемоглобина в червените кръвни клетки. Спекулираме, че липсата на подобрение в нивата на HbA1c и леко повишаване на нивата на глюкозата на 12 седмици се дължат отчасти на генетичното пристрастие на животинския модел. Тоест, условието по db/db спонтанно мутиралите мишки са строги с LAB, защото това не е химично съединение. Остава да се види дали BNR17 може значително да понижи стойностите на HbA1c и нивата на OGTT при различни животински модели на диабет.

Има някои съобщения за антидиабетния механизъм на LAB. При захарен диабет, приложение на Лактобацилус казеи както на диабетни, така и на неинсулинозависими диабетни животни ефективно инхибира появата на диабет, като контролира активността на имунната система (Matsuzaki и др. 1997а, б). Съобщава се, че повишаването на непоносимостта към глюкоза и хипергликемията е значително забавено от храненето на Лактобацилус GG по време на прогресията на стрептозотоцин-индуциран диабет при плъхове (Tabuchim и др. 2003). Съдържащ пробиотик дахи Lactobacillus acidophilus и Лакт. казеи значително забави прогресирането на диабета при диети с високо съдържание на мазнини чрез забавяне на биохимичните промени (Yadav и др. 2007).

Наскоро много изследователи се съсредоточиха върху връзката между микробиома на чревните органи на бозайниците и диабета, предполагайки, че чревните микроорганизми играят важна роля в метаболизма и началото на заболяването (Bajzer and Seeley 2006; Ley и др. 2006; Търнбоу и др. 2006; Рю и др. 2008). Мога ли и др. (2007) съобщават, че увеличаването на съдържанието на бифидобактериални вещества в червата значително и положително корелира с подобрения глюкозен толеранс, секрецията на инсулин и нормализирания възпалителен тонус. Освен това, Оуен и др. (2006) предполагат, че кърменето в ранна детска възраст е свързано с намален риск от диабет тип 2 по-късно в живота. Мартин и др. (2003) анализират LAB, изолиран от мляко, млечна арелоа и кожа на гърдите на здрави майки, и устни тампони и изпражнения на съответните им кърмени бебета. Те предполагат, че кърменето може да бъде важен източник на LAB за червата на бебето и че LAB, присъстващ в млякото, може да има ендогенен произход. Следователно, в нашето проучване ние спекулираме, че LAB, съдържащ се в майчиното мляко, може да бъде една от важните съставки за профилактика на диабета, въпреки че не е изяснено кой материал в кърмата е свързан с полезния антидиабет ефект.

В заключение демонстрирахме антидиабетния ефект на Лакт. газсери BNR17, получен от майчиното мляко при перорално хранене през db/db мишки. BNR17 понижава нивата на кръвната захар и подобрява симптомите, свързани с диабет. Планираме по-нататъшни изследвания на ефекта на BNR17 върху появата на диабет, използвайки високофруктозен диетичен животински модел.