Резюме

Заден план

Чревната микробиота е тясно свързана със здравето на гостоприемника и е силно повлияна от състава на храната. Китайските билки обикновено се използват като естествени фуражни добавки в животновъдството. Следователно, настоящото проучване оценява влиянието на хранителните добавки със зелен чай и прах от черница от черница върху микробиотата на пилешките черва. Съставите на микробиотата на червата бяха определени с помощта на 16S rDNA секвениране.

Резултати

Подобрено относително изобилие от Бактероиди, Prevotella, и Мегамонас са открити в пилешките черва, когато диетата от черница е добавена към диетата. Обратно, по-голямо количество потенциално патогенни Галибактериум е открит в пилешките черва, когато диетата е допълнена със зелен чай на прах. Тези резултати показват, че прахът от зелен чай и черница от черница могат значително да повлияят на чревната микробиота на пилета, като променят състава им.

Заключения

Наложително е да се изследват и оценят ефектите на китайските билки върху здравето на животните, преди те да бъдат въведени като фуражни добавки в животинското производство.

Заден план

Чревната микробиота включва резидентните микроорганизми в храносмилателния тракт на гостоприемника. Чревната микробиота е тясно свързана със здравето на гостоприемника и състоянието на заболяването [1,2,3]. През последните години голямо количество изследвания показаха, че диетата влияе върху състава на микробиотата на животинските черва. Кучетата, хранени с естествена диета, имат по-разнообразен и обилен микробен състав в чревната микробиота, отколкото кучетата, хранени с търговски фураж [4]. Диетата на основата на сурово месо влияе върху фекалния микробиом при здрави кучета [5]. Зелен чай на прах в комбинация с един щам от Lactobacillus plantarum успя да насърчи растежа на Лактобацилус в червата на мишки C57BL/6J [6]. Добавките с етерично масло оказват положителен ефект върху чревната микробиота при бройлерите Ross [7].

Като безопасна алтернатива на антибиотиците, много китайски билки се използват като естествени фуражни добавки в животновъдството [8, 9]. Сред тези естествени фуражни добавки, зеленият чай и черничевият лист често се използват като фуражни добавки в домашните птици [10,11,12,13,14,15]. Известно е, че зеленият чай има свойства за укрепване на здравето [16,17,18]. Някои проучвания показват, че екстрактите от зелен чай селективно инхибират растежа на патогенни бактерии, като същевременно не показват ефект върху растежа на полезните бактерии [19,20,21]. Зеленият чай на прах, който все повече се използва като допълнителна съставка в храните, може да повлияе на чревната микробиота при мишките [6]. Влиянието на зеления чай на прах като фуражна добавка върху чревната микробиота не е докладвано при домашните птици. Листата на черницата и техните екстракти са били използвани в народната медицина поради терапевтичните им свойства, особено заради техните противовъзпалителни, антидиабетни и антиоксидантни свойства [22,23,24]. Ефектът на черничевите листа върху микробиотата на пилешките черва не е оценяван по-рано.

Използването на следващо поколение секвениране на 16S рРНК гени значително подобри нашето разбиране за бактериалната общност, присъстваща в стомашно-чревния тракт (GI) на различни животински видове [25, 26]. В настоящото проучване ние извършихме секвениране на 16S рДНК, за да изследваме ефектите на зеления чай на прах и черничевия лист на прах върху чревните микробиотични състави на пилето. Нашите резултати показват, че прахът от зелен чай и черница от черница могат значително да повлияят на чревната микробиота на пилета, като променят нейния състав.

Резултати

Микробно разнообразие в пилешките черва

За сравнение на проби с различни дълбочини на секвениране, всяка проба беше разредена до 8708 последователности. При праг от 97% идентичност на последователността, във всички проби са идентифицирани 36 243 уникални OTU. Във всички проби, общи последователности са определени за 41 тила (3 археални и 38 бактериални). Фиксира (60,32 ± 21,96%), Протеобактерии (18,96 ± 17,99%), Бактероидети (11,55 ± 17,84%), Актинобактерии (4,50 ± 3,30%), Synergistetes (0,84 ± 1,61%), Цианобактерии (0,72 ± 0,85%), Тенерикути (0,63 ± 0,93%), Euryarchaeota (0,41 ± 0,84%), Хлорофлекси (0,31 ± 0,87%), Ацидобактерии (0,28 ± 0,86%), Спирохети (0,20 ± 0,42%), Кренархеота (0,16 ± 0,49%) и Планктомицети (0,13 ± 0,36%) бяха доминиращата фила във всички проби. Съставът на всяка проба на ниво филум е показан на фиг. 1. Наблюдават се значителни промени между групите A, B и C за алфа разнообразието на Бактероидети и Протеобактерии. По отношение на алфа разнообразието на Бактероидети, имаше значително увеличение в група В в сравнение с тази в група С (Еднопосочен ANOVA, P Фиг. 1

върху

Доминираща фила в чревната микробиота на пиле. Във всички проби общите последователности са разпределени на 41 фила. Процентната диаграма показва състава на доминиращата фила в микробиотата на пилешките черва в различни групи. Групи A, B, C представляват три различни лечения, както следва: Група A е хранена с базална диета + 2% зелен чай на прах; група В е хранена с основна диета + 4% черница на прах; група С е хранена само с основна диета като контрол. Всяко лечение се извършва в три повторения (маркирани 1, 2 и 3)

Разлики в чревния микробен състав между различните групи

Основният координатен анализ (PCoA) беше проведен въз основа на претеглени разстояния на UniFrac за оценка на микробното разпределение между трите групи. Претегленият график на UniFrac показа, че чревната микробна общност от групата A-B е силно отделена от тази на групата C. Освен това се наблюдава значително разделяне между групите фуражни добавки (група А-В) и групата на не-фуражните добавки (група С) за PC1 и PC2 (съответно 58.07 и 19.97% от дисперсията), P Фиг. 2

Диференциация на чревната микробиота на пилешко месо с различни фуражни добавки. а PCoA анализ, базиран на претеглено разстояние UniFrac. Всяка точка представлява проба. Първият основен компонент се нанася върху оста X, а вторият основен компонент се нанася върху оста Y. Цветовете показват различни групи. Процентът на всяка ос показва приноса към несъответствието между пробите. PCoA, основен координатен анализ; Група А е хранена с базална диета + 2% зелен чай на прах; група В е хранена с основна диета + 4% черница на прах; група С е хранена само с основна диета като контрол. б Филогенетични профили на специфични бактериални таксони и преобладаващи бактерии сред трите различни групи, както е определено с помощта на LEfSe анализ. Таксоните на биомаркерите са увеличени от цветни кръгове и сенчести области. Диаметърът на всеки кръг е в сравнение с изобилието от таксони в общността. ° С Топлинна карта за изобилие на групи, показваща нормализирани стойности на диференциално изобилни родове от трите групи. Името на групата е нанесено върху оста X, а оста Y представлява рода. Цветовете отразяват относителното изобилие от ниско (зелено) до високо (червено)

Размерът на ефекта на линейния дискриминант (LDA) (LEfSe) [27] е използван за идентифициране на специфични филотипове, отговарящи на фуражни добавки във всяка група (фиг. 2б). LEfSe открива 13 бактериални таксономични клада, показващи статистически значими разлики между трите групи. На семейно ниво относителното изобилие от Porphyromonadaceae, Lachnospiraceae, и Veillonellaceae бяха значително увеличени в група В, докато тези на Clostridiaceae, и Micrococcaceae и Lactobacillaceae бяха значително увеличени съответно в групи А и С. На ниво род, Парабактероиди, Мегамонас, Megasphaera и Phascolarctobacterium са били свръхпредставени в група Б, докато Кандидат Артромит беше свръхпредставен в група А и Ротия и Лактобацилус са свръхпредставени в група В. Резултатите освен това показват, че фуражните добавки, зеленият чай на прах и черничевите листа на прах силно повлияват състава на микробиотата на пилешките черва.

HemI може да бъде полезен набор от инструменти за удобно визуализиране и манипулиране на топлинните карти [28]. За да осигурим по-визуална представа за вариацията на изобилието на доминиращите родове в пробите, използвахме софтуера Hem1 (вж. Http://hemi.biocuckoo.org/download/HemI_Manual.pdf) за изграждане на топлинни карти (фиг. 2в). Резултатите показват, че бактериите са значително увеличени в трите групи. Мегамонас, Бактероиди, и Превотела има по-голямо количество в група В, отколкото в групи А и С, и Лактобацилус имаше по-голямо количество в групи А и С. Това демонстрира, че фуражът, допълнен с черничев лист на прах, води до променено богатство на бактерии в сравнение с този без добавка (група С).

Дискусия

Ефект на зеления чай на прах върху чревната микробиота на пилето

Неотдавнашно проучване разкри, че трилиони микроорганизми живеят в пилешките черва, като челните четири вида са Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria и Bacteroidetes [29]. В съответствие с това проучване, четирите най-добри фила също са открити в пилешките черва от различни групи.

Ефект от черничев лист на прах върху чревната микробиота на пилето

Заключения

В заключение, нашето проучване показва, че прахът от зелен чай и черница от черница могат значително да променят състава на микробиотата на пилешките черва. Двете билкови фуражни добавки обаче повлияват на чревната микробиота по различен начин, което показва, че те могат да упражняват различни и противоположни ефекти върху здравето на пилетата. По този начин е наложително да се изследват и оценят ефектите на китайските билки върху здравето на животните, преди те да бъдат въведени като фуражни добавки в животинското производство.

Методи

Популация от животни и дизайн на изследването

Това проучване беше проведено при стриктно спазване на разпоредбите за управление на животните в Китайската народна република. Здрави женски пилета с брада Huiyang бяха избрани от националната развъдна площадка за брадат пилета Huiyang на Гуандун Jinzhong Земеделие и технологии за отглеждане на животни Co., Ltd. Тази порода птици е местен бройлер.

Всички пилета бяха евтаназирани чрез интравенозно предозиране с барбитурат, последвано от цервикална дислокация. Съдържанието на червата им бе незабавно събрано от ceca в рамките на 5 минути от евтаназията, незабавно поставено в криогенни флакони, съхранено веднага при - 20 ° C в преносим фризер, доставено в лабораторията и съхранено при - 80 ° C до екстракция на ДНК.

ДНК екстракция, PCR и 16S секвениране

Комплектът за геномна екстракция на ДНК за съдържанието на червата (TIANGEN Biotech, Китай) беше използван за извличане на обща ДНК от съдържанието на червата. Комплектът е базиран на технология на силициевата мембрана и осигурява специална буферна система с таблетка InhibitEX за екстракция на gDNA на проби (подробна процедура е показана в TIANamp Stool DNA Kit Handbook, http://www.tiangen.com/asset/imsupload/up0044925001433136195.pdf) . Девет ДНК проби от всяко лечение бяха разделени на случаен принцип в три пула, за да се получат три ДНК проби на пул. Концентрацията и чистотата на ДНК се определят с помощта на спектрофотометър Nanodrop 2000. Усилването на V4-V5 хипервариабилната област на микробния 16S rRNA ген използва универсалните праймери, видени в [40]. 25 μL реакционна смес за амплификация на PCR включва 1 × PCR буфер, 1,5 mM MgCl2, всеки праймер при 1,0 μM, 0,25 U от Ex Taq (TaKaRa, Китай) и 10 ng геномна ДНК. Процедурата за PCR амплификация беше както следва: денатуриране при 94 ° C за 3 минути, последвано от 30 цикъла (всеки цикъл се състоеше от денатуриране при 94 ° C за 40 s, отгряване при 56 ° C за 60 s и удължаване при 72 ° C за 60 s) и окончателно удължаване при 72 ° С за 10 минути.

След PCR амплификация, двата PCR продукта се смесват, за да работят на 1,2% агарозен гел. След изрязване на целевата лента, последвано от пречистване с помощта на комплект за екстракция на ДНК гел SanPrep (Sangon Biotech, Китай). Всички ампликони бяха събрани заедно с еднакво моларно количество от всяка проба и секвенирани с помощта на система Illumina MiSeq в Guangdong Meilikang Bio-Science, Ltd., Китай.