Резюме

Бактериалната транслокация се определя като преминаване на жизнеспособни бактерии от стомашно-чревния тракт към мезентериалните лимфни възли и други извън чревни органи като черния дроб, далака и кръвта (1). Въпреки че по-голямата част от настоящите знания за транслокацията произхождат от проучвания върху животни, сега е широко прието, че системното разпространение на микроорганизми от червата участва в патогенезата на тези необясними и потенциално летални септични състояния, които се наблюдават при имунокомпрометирани пациенти (2, 3), при пациенти с портална хипертония и цироза на черния дроб (4, 5) и след голяма термична (6, 7) или механична травма (8, 9) .

лишаване

Друга популация, предразположена към придобиване на грам-отрицателен сепсис при липса на очевиден фокус на входа, са новородените, особено когато са недоносени (10). Възможните обяснения за тази уникална чувствителност включват незрялост на стомашно-чревния тракт по време на колонизация с бактерии (11) и все още не напълно развита имунна система (12), неспособна да изчисти напълно проникващите бактерии. Експериментална подкрепа за възгледа, че транслокацията на бактериите се улеснява, когато чревната бариера е незряла, идва от проучвания на Glodeи др. (13) и Плюшке и др. (14), показващо, че орално инокулиран Ешерихия коли K1 може да бъде възстановен от мезентериалните лимфни възли, черния дроб и кръвта при новородени плъхове. Най-преките доказателства за бактериална транслокация при новороденото при човека вероятно са представени от Ламберт-Зеховски и др. (15), които демонстрират генетична свързаност на няколко щама на Enterobacter cloacae изолирани последователно от култури на изпражнения, кръв и цереброспинална течност при бебе, което е имало бактериемия и менингит.

Някои доказателства сочат, че податливостта към поемане на бактерии от неонаталните черва може да бъде допълнително засилена чрез промяна в хранителния статус на гостоприемника. От клиничните наблюдения и от епидемиологичните данни е добре оценено, че хранителните дефицити са свързани с повишена честота на инфекции (16). Изглежда, че тази връзка преобладава при изкуствено хранени бебета, докато майчиното мляко има известен антиинфекциозен ефект (17, 18). Ранната хранителна депривация, подобно на изкуственото хранене, може да промени пропускливостта и/или архитектурата на чревната лигавична бариера (19–22), да намали имунната защитна система на гостоприемника (23–25) и да наруши нормалния баланс, който съществува между различните членове на GI бактериална микрофлора (26, 27). Тези промени са идентифицирани от Deitch и Berg (28), за да представляват основните рискови фактори за бактериална транслокация при възрастни гризачи.

По време на настоящите експерименти първо изследвахме дали транслокация на местни бактерии възниква спонтанно в следродилния период. Също така изследвахме ефекта от ранната хранителна депривация и режима на хранене върху бактериалната транслокация, използвайки модели на естествено и изкуствено хранене. Неонаталните плъхове са използвани като субекти, тъй като тези животни са сравнително незрели при раждането и следователно служат като модел за недоносеното новородено (29, 30) .

МЕТОДИ

Животни

Бременни плъхове Sprague-Dawley с бременност по време на бременността са закупени от развъдни лаборатории Himberg, Виена, Австрия. Те имаха свободен достъп до вода и редовно чау и бяха държани в 12-часов цикъл светлина-тъмнина. На плъховете е било разрешено да раждат спонтанно. За тези експерименти са използвани само свидетели на раждания. Всички малки бяха претеглени веднага след раждането.

Експериментални групи и протокол за хранене

Експеримент I. Петдесет и шест новородени мъжки и женски малки плъхове от седем котила бяха разпределени в една от четирите различни групи в случаен ред, за да се елиминира влиянието на варирането между интервалите. 1) Плъховете са проучени незабавно и са служили за контрол на новородените (н = 15).2) Плъхове останаха до язовира и бяха кърмени ad libitum (н = 15). Две отделни групи плъхове, единият кърмен, а другият изкуствено хранени, са подложени на ограничаване на храната, за да предизвикат недохранване (31, 32). Графиците на хранене за постигане на подчертано недохранване без високи нива на смъртност са установени в предварителни проучвания. 3А) На малките беше позволено да сучат 30 минути на всеки 12 часа при плътност от 7 плъха на язовир (н = 13). Между периодите на хранене малките бяха отделени от язовира и изгладнени. 3В) Плъхове, подложени на ограничено хранене с адаптирано мляко, са взети незабавно от всяка майка преди започване на сученето (н = 13). Кученцата се хранеха на всеки 6 часа с капкомер с формула в количества, изчислени да осигурят енергиен прием от 250-300 kcal/(kg · ден). Различни храни се поддържат в продължение на 5 дни.

Експеримент II. Двадесет и седем новородени плъхове от четири котила бяха разпределени на случаен принцип в една от двете групи: в първата група плъховете бяха хранени с адекватни количества формула на сонда, изчислена да осигури енергиен прием от 500 kcal/(kg · d), както е описано другаде ( 30, 33); във втората група плъховете сучеха ad libitum до язовира и бяха подставени интубирани на всеки 6 часа. Плъховете се анализират след 3 дни.

Кученца, които не сучеха ad libitum до язовира бяха настанени в отделни чаши от стиропор, плаващи във водна баня, поддържана при 37 ° C. За симулация на майчините дейности, гениторекталната област беше стимулирана да предизвика изпразване и дефекация с помощта на фина четка. Всички малки бяха претегляни по едно и също време всеки ден.

Формулата за мляко от плъхове (предоставена щедро от Milupa Nutrition Co., Австрия) е съставена съгласно публикувани данни за състава на мляко от плъхове (34). Всеки 100 ml съдържа 175 kcal, 9,6 g протеин, 2,9 g въглехидрати и 12,9 g мазнини с минерали и витамини, приблизително тези, присъстващи в млякото от плъхове. Основните енергийно осигуряващи съставки на диетата с формула бяха царевично масло (12,7 g/100 ml), натриев казеинат (7,2 g/100 ml) и лакталбумин (3,2 g/100 ml), подобно на използваното от предишни работници (33, 34). Осмоларността на диетата е била 346 mosmol/L, измерена чрез депресия на точката на замръзване (за сравнение, осмоларността на млякото от плъхове е 352 mosmol/L) (34). Млечната формула се приготвя на всеки 12 часа от прахообразни съставки. Аликвотни части от останалата формула от всяка 12-часова порция се култивират върху кръвен агар за откриване на бактериално замърсяване. Всички тези култури бяха отрицателни.

Тестване за бактериална транслокация

Морфология

Двусантиметрови участъци от дисталното тънко черво от всяко кученце се фиксират чрез потапяне в 10% буфериран разтвор на формалдехид за светлинна микроскопия. Образците бяха оцветени с хематоксилин и еозин, трихром на Masson и периодична киселина-Schiff. Всички проби бяха оценени от един наблюдател, който не знае за плана на изследването.

Непрекъснатите данни се изразяват като средно ± SEM и се анализират чрез дисперсионен анализ с Tukey post hoc тест или от несдвоения двустранен т тест, според случая. Прекъснатите данни бяха оценени чрез х2 анализ. стр стойности

РЕЗУЛТАТИ

Ефект на различните хранения върху телесното тегло.Таблица 1 показва, че наддаването на тегло е сходно, когато кърмата или адаптираната диета се предоставят в адекватни количества. Ограниченото хранене на която и да е от диетите води до значително забавяне на растежа.

Морфология. Микроскопски дисталното черво е нормално при животни, хранени с нормални или намалени количества кърма. За разлика от това, при плъхове, хранени с нормални или ограничени количества формула, бяха открити две ненормални характеристики. Субмукозният оток е постоянна находка при 4 от 13 нормални плъхове, хранени с адаптирано мляко (стр ТАБЛИЦА 2 Бактериална колонизация на стомашно-чревния тракт *

Проучвания за транслокация. Както е показано в таблица 3, всички бактериални култури са отрицателни при новородени контролни плъхове, убити непосредствено след раждането. След 5 дни нормално кърмене бактерии се култивират от мезентериалните лимфни възли при 27% и от черния дроб и далака при 20% от плъховете. Подобни резултати бяха получени, когато сученето беше ограничено. За разлика от това, ограниченото или нормално хранене с адаптирано мляко води до драстично увеличаване на бактериалната транслокация към извън чревни органи, включително системната кръв, която остава стерилна във всички останали групи.

Таблица 4 представя различни бактериални видове, възстановени от мезентериалните лимфни възли и системни органи. При плъхове, хранени с кърма, транслоцираните бактерии обикновено се идентифицират като Enterococcus sp.,Е. coli, и Staphyloccus epidermidis. Тези организми могат също да бъдат изолирани от култури на организми с плъхове, хранени с формула. Освен това изкуственото хранене е свързано с достатъчно транслокация наПротея sp. и Enterobacter sp., видове, които не са наблюдавани в органи от кърмени животни. Позитивните култури често отглеждат повече от един вид, особено при плъхове, хранени с формула. Във всички отделни малки, видове, които са били възстановени от която и да е органна култура, са били част от чревната им флора.

ДИСКУСИЯ

Данните, представени тук, показват, че бактериалната транслокация от червата се случва спонтанно при новородени плъхове и се увеличава драстично чрез изкуствено хранене. Освен това те предполагат, че ограничаването на храната не засилва транслокацията на бактериите.

Изкуственото хранене включва няколко характеристики, всяка от които би могла да насърчи транслокацията. Това са методът на хранене, влиянието на околната среда и диетата сами по себе си.

Нивата на транслокация остават ниски след фалшиво изследване на сучещите контроли, което означава, че манипулацията, свързана с метода на хранене, е малко вероятно източник на бактериална транслокация при плъхове, хранени с тръба. Оказва се още по-малко вероятно транслокацията да е предизвикана чрез капковия метод, който не е свързан с потенциална травматизация на хранопровода и/или стомашната лигавица, както е храненето в сондата. В допълнение, бактериалните култури от формулата са постоянно отрицателни, което показва, че бактериите не са инокулирани със замърсена млечна диета. Взети заедно, повишените нива на транслокация при изкуствено хранени плъхове най-вероятно не се дължат на различни методи на хранене.

Две линии на доказателства предполагат, че ефектът от изкуственото хранене върху транслокацията не е произведен чрез отделяне на потомството от язовира и от майчината среда. Първо, транслокацията е била много по-висока при плъхове, хранени с ограничена формула, отколкото при плъхове, хранени с ограничено майчино мляко, въпреки че и двете групи са били държани в инкубатори (с изключение на 60 минути на ден, през които кърмените плъхове са имали възможност да сучат). Второ, нивата на транслокация са количествено сходни при плъхове, хранени с нормално или ограничено майчино мляко, въпреки факта, че първите животни са останали при язовира, а вторите са държани отделени от майките си.

Според нас най-вероятната интерпретация на настоящите резултати е, че ефектът от изкуственото хранене върху бактериалната транслокация се е медиирал предимно от хранителния режим (и/или липсата на кърма). В изкуствената формула липсват многобройни антибактериални компоненти, присъстващи в коластрата и кърмата на плъхове и хора, включително специфични хуморални антитела, имунокомпетентни клетки и неспецифични фактори като лизозим, комплемент и лактоферин (37). Някои от тези фактори могат да имат местни ефекти, когато се предават непокътнати по червата. Секреторният IgA, например, представлява основната защита срещу прикрепването на чревни бактерии към клетките на лигавицата (38); Ig от тази категория се съдържат в кърмата в значителни количества; те обаче все още не се произвеждат в незрелите черва на новороденото (11). В диетата с формула също липсват фактори, стимулиращи растежа и хормони, които допринасят за нормалното съзряване на чревната лигавица (39) и по този начин могат да нарушат функцията на GI бариера, както се наблюдава при изкуствено хранени новородени животни (21) и хора (22) .

Резултатите при плъхове, подложени на ограничаване на храната, са общо съгласие с проучвания при възрастни гризачи, които показват, че недохранването не засилва транслокацията на бактериите (40). Не успяхме да повишим нивата на транслокация чрез ограничено сучене, въпреки че плъховете, подложени на този режим на хранене, постоянно не успяваха да наддават на тегло за 5-дневен период. При плъхове, хранени с адекватни или ограничени количества формула, транслокацията се увеличава до подобна степен, въпреки че първите плъхове наддават на тегло, а вторите не. Тъй като тези две групи плъхове се различават и в други отношения (т.е. метод на хранене, постеля, възраст) и тъй като увеличаването на теглото само по себе си може да не е идеален индекс на адекватност на диетата (34), някои наслагвани ефекти на недохранване върху транслокацията при плъхове, хранени с адаптирано мляко не могат да бъдат изключени със сигурност. По същия начин няма очевидни доказателства за такъв ефект.

Въпреки че не сме изучавали механизма на процеса на транслокация, всички основни рискови фактори според Deitch и Berg (28), както е посочено във въведението, са присъствали при изкуствено хранени плъхове и биха могли да действат съгласувано.

Първо, новороденият плъх е относително имунодефицитен при раждането, отчасти защото трябва да абсорбира значителна част от системния си пул Ig от кърмата през червата. Липсата на кърма може допълнително да наруши имунната система, както бе споменато по-горе.

На второ място, съставът на бактериалната микрофлора на стомашно-чревния тракт е нарушен и показва повишени нива на бактериална популация в червата и в двете групи храни с адаптирано хранене. Възможните фактори, които биха могли да променят бактериалната флора, включват разлики в диетата, намалена подвижност и влияния на околната среда. Добре е оценено, че изкуственото хранене може да промени модела на колонизация на GI и при човешки бебета, макар и в по-малка степен, отколкото наблюдаваме при плъхове (27) .

И накрая, морфологични изменения на тънкочревната лигавица, характеризиращи се с субепителен оток и неравен интерстициален кръвоизлив, бяха демонстрирани при значителен брой плъхове, хранени с формула. Предполагаме, че бактериалните токсини във връзка с необичайно съставеното и засилено бактериално натоварване, променената подвижност (41) и хипоперфузията на чревната микроциркулация поради септицемия (42) са потенциално налични и могат да предизвикат утаяване на лигавичните лезии.

Ясно е, че настоящите резултати при плъхове не могат да бъдат пряко приложени към ситуацията при човека. Въпреки това, нашите открития подкрепят концепцията, че изкуственото хранене може да промени функцията на чревната бариера и да улесни системната инвазия на бактерии от червата при незрялото новородено.