З. Нурул Адилах

Катедра по хранене и диететика, Факултет по медицина и здравни науки, Universiti Putra Малайзия, 43400 Serdang, Selangor, Малайзия

Winnie-Pui-Pui Liew

Катедра по хранене и диететика, Факултет по медицина и здравни науки, Universiti Putra Малайзия, 43400 Serdang, Selangor, Малайзия

С. Мохд Редзван

Катедра по хранене и диететика, Факултет по медицина и здравни науки, Universiti Putra Малайзия, 43400 Serdang, Selangor, Малайзия

Аз съм в

Катедра по хранене и диететика, Факултет по медицина и здравни науки, Universiti Putra Малайзия, 43400 Serdang, Selangor, Малайзия

Резюме

2.2. Животни

Двадесет и четири (n = 24) мъжки плъхове Sprague Dawley (на възраст 7-8 седмици, 290-300 g) са закупени от звеното за животински ресурси (ARU), Катедра по ветеринарна патология и микробиология, Факултет по ветеринарна медицина, Университет Путра Малайзия (UPM). Плъховете бяха държани при стайна температура при стандартни условия на светлина (12 часа цикъл светлина-тъмнина) и регулирана температура (20–22 ° C) и вентилация в изследователската къща за животни от Отделението за сравнителна медицина и технологии (COMeT), Институт по биология, UPM. Два плъха бяха настанени в клетка с дървени стърготини. Процесът на почистване на клетките се извършва два пъти седмично и водоснабдяването се променя ежедневно. Етично одобрение за това проучване върху животни е дадено от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните, UPM (UPM/IACUC/AUP-R098/2016).

2.3. Изготвяне на диета

Беше подготвена диета с високо съдържание на протеини (HP), базирана на рецепта Envigo [15]. Тази диета съдържа приблизително 40% протеини по отношение на калориите.

2.4. Експериментално проучване

2.5. Събиране на урина

След последната доза AFB1, всички плъхове са държани индивидуално в метаболитна клетка за събиране на урина. След това пробите от урина се съхраняват при -80 ° C до анализ.

2.6. Отнемане на кръв

Около 3–10 ml кръв бяха изтеглени и събрани с помощта на епруветка за събиране на кръв със серумен сепаратор (Becton, Dickinson and Company (BD), Plymouth, UK). Кръвният серум се отделя с помощта на Kubota 2810 центрофуга (Токио, Япония) при 4 ° С за 13 минути при 2000 g. Серумът се събира и съхранява при -80 ° С до анализ.

2.7. Тест за чернодробна и бъбречна функция

Нивата на аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), алкална фосфатаза (ALP), общ протеин и албумин бяха измерени за функцията на черния дроб, докато нивата на урея (UREA) и креатинин в кръвта (CREA) бяха измерени за оценка бъбречна функция. Тези тестове бяха анализирани с помощта на напълно автоматизиран клиничен анализатор BiOLiS 24i Premium в клиничната лаборатория по хематология и биохимия на Факултет по ветеринарна медицина, UPM.

2.8. Анализ на AFM на урината1

Урината беше анализирана за наличие на AFM1 с помощта на ELISA комплект, по-специално за определяне на AFM1 в урината (Helica Biosystems, Inc., Санта Ана, Калифорния, САЩ) [19].

2.9. Хистопатологично изследване

Цялото тънко черво, дебелото черво, черния дроб и далака бяха отстранени и фиксирани в 10% разтвор на формалин, неутрален буфер (R&M Chemicals, UK), за 3 дни при стайна температура. Фиксираните тъканни проби се измиват няколко пъти с 80–95% етанол, последвано от дехидратация в абсолютен етанол преди изчистване с ксилол и вграждане в парафин. Вградените в парафин тъкани бяха разделени последователно с дебелина 4 μm. Срезите бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) за качествен хистологичен анализ.

2.10. Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на софтуера SPSS версия 20 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс). Средните разлики в чернодробните и бъбречните биомаркери са анализирани с помощта на ANOVA между групите и е извършен post hoc анализ (тест на Tukey) за всеки значим ANOVA изход. От друга страна, разликата в нивото на AFM1 в урината се определя чрез независим t-тест. Резултатите са изразени като средно ± SD. Нивото на значимост е определено на p Фигура 1). Това наблюдение е в съгласие с други изследвания [14, 20]. AFB1 може да причини загуба на тегло и да намали консумацията на храна, като намали нивото на лептин [21], което пряко влияе върху енергийния баланс и наддаването на телесно тегло [22]. В настоящото проучване не се наблюдава значителна разлика в наддаването на телесно тегло между група А (58,5 ± 4,6 g) и група С (53,33 ± 7,9 g), тъй като HP диетата подобрява детоксикацията на AFB1 [12]. Въпреки това, плъхове от групи В (47,67 ± 5,5 g) имат значително по-ниско наддаване на тегло (p 8 CFU на пробиотици [26]. В допълнение, добавките на видовете Lactobacillus са причинили значително намаляване на телесното тегло и телесните мазнини при жени) [27].

високо

Сравнение на наддаването на телесно тегло на плъхове между три групи. A: само с високо съдържание на протеини (HP), B: с високо съдържание на протеин, Lactobacillus casei Shirota и афлатоксин B1 (HP + LcS + AFB1), C: високо съдържание на протеини и афлатоксин B1 (HP + AFB1).

Освен това пробиотичните добавки влияят върху енергийния метаболизъм на гостоприемника чрез производството на късоверижни мастни киселини (SCFA) [28]. Проучване [29] показа, че добавянето на Lactobacillus salivarius ssp. salicinius JCM 1230 и Lactobacillus. agilis JCM 1048 в продължение на 24 часа в симулирана пилешка цекума значително повишава образуването на пропионат и бутират. Всъщност L. acidophilus успя да увеличи концентрацията на SCFAs в реактора SHIME (Simulator of Human Microbial Ecosystem) [30]. Увеличението на SCFAs е свързано с увеличаване на циркулиращите концентрации на аноректични чревни хормони като пептид (PYY) и глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1) и тези чревни хормони причиняват намаляване на енергийния прием [31]. Освен това, SCFA намалява теглото чрез увеличаване на енергийните разходи и подобрява окисляването на мазнините и термогенезата чрез увеличаване на скоростта на консумация на кислород [32].

3.2. Тест за чернодробна функция

AST и ALT са ензими с чернодробна функция и повишената активност на тези ензими над определена граница показва чернодробни лезии или други видове увреждания [33]. Плъховете в група А са имали високо ниво на AST и нивото е значително различно в сравнение с плъховете в група С (Таблица 1). Този резултат е в противоречие с предишно проучване, тъй като експозицията на AFB1 повишава нивото на AST [14]. Дозировката на AFB1, дадена на плъховете в настоящото проучване, е подобна на тази в проучване, проведено от Nikbakht Nasrabadi et al. [14]. Възможно обяснение на това откритие може да се дължи на вида на диетата. Както бе споменато по-горе, HP диетата подобрява детоксикацията на AFB1 [12]. HP диетата има ефект и върху чернодробните ензими, както е установено в проучване върху животни [34]. След HP диета, чернодробните ензими засилват катаболизма на аминокиселината [35]. Тъй като диетата съдържа високо съдържание на протеини, черният дроб ще трябва да отделя повече ензими за катаболизма на аминокиселината. Всъщност нарастването на нивото на AST между групите е успоредно с консумацията на храна, тъй като плъховете от група А имат по-висока консумация на храна от плъховете от група В и група С.

маса 1

Биохимичен анализ на кръвна проба от плъх за изследване на чернодробната функция.

Параметър ALT (U/L)
p стойностAST (U/L) p стойностALP (U/L)
p стойност ALB (g/L) p стойностTP (g/L) p стойност
Група
A48,60 ± 12,13 a 0,987196,40 ± 45,23 b 0,049164.60 ± 28.43 a 0,38531,52 ± 0,89 a 0,25569,96 ± 3,70 a 0,394
Б.47,60 ± 10,62 a 163.80 ± 2.26 ab 168,40 ± 10,92 a 30,90 ± 0,65 a 71,90 ± 1,81 a
° С48,00 ± 7,54 a 142.60 ± 19.62 a 181,80 ± 15,96 a 30,32 ± 1,51 a 69,54 ± 2,56 a

A: само с високо съдържание на протеини (HP), B: високо съдържание на протеин, Lactobacillus casei Shirota и афлатоксин B1 (HP + LcS + AFB1), C: високо съдържание на протеин и афлатоксин B1 (HP + AFB1), ALT: аланин трансаминаза, AST: аспартат трансаминаза, ALP: алкална фосфатаза, ALB: албумин, TP: общ протеин. p стойности са получени от дисперсионен анализ (ANOVA). Стойностите се изразяват като средна стойност ± SD. Стойностите с различна горна буква се различават значително (p Таблица 1). И нивата на AST и ALP са по-високи от нормалните граници (AST: ≤40 IU/L, [36], ALP: 44 до 147 IU/L, [37]), но не се наблюдава чернодробно увреждане. Освен това биомаркерите на други чернодробни функции като ALT, общ протеин и албумин остават в нормалните граници. Повишеното ниво на AST и ALP, наблюдавано в това проучване, може да бъде механизмът за адаптация на плъховете към HP диетата. Адаптацията е умишлен отговор, който се изпълнява от телесна система към нов тип консумирана диета, която причинява промени във функционалното състояние за по-добро представяне на тялото [38]. Това беше видно от проучване върху животни, проведено от Johnson et al. [39], тъй като маймуните, които са получили високо протеинова диета, са имали повишено ниво на ALP. Следователно, промените в биомаркерите на чернодробната функция, особено AST и ALP, са причинени от консумацията на HP диета и не се дължат на увреждане на черния дроб. Ефектът от HP диетата върху чернодробните ензими зависи от процента на макронутриентите, използвани в експерименталната диета [40].

3.3. Тест за бъбречна функция

Нивата на урея при плъховете в групи A, B и C са малко по-високи от нормалните граници от 5,4 до 7,9 mmol/L, както се съобщава при плъхове [41] (Таблица 2). Приемът на протеини причинява промени в активността на цикъла на уреята [35]. Диетичният протеин ще се метаболизира до основни и несъществени аминокиселини [42]. В допълнение, аминокиселината ще се използва за синтезиране на протеин или превръщането му в урея в черния дроб [42]. Производството на урея зависи от количеството консумиран хранителен протеин [42, 43].

Таблица 2

Биохимичен анализ на кръвна проба от плъх за тест за бъбречна функция.

Параметър Урея (mmol/l)
p стойност Креатинин (umol/L) p стойност
Група
A10,82 ± 0,26 b 0,03246,2 ± 3,34 a 0,772
Б.10,02 ± 0,73 a 45,0 ± 2,54 а
° С10,10 ± 0,14 ab 45,0 ± 3,08 a

A: само с високо съдържание на протеин (HP), B: с високо съдържание на протеин, Lactobacillus casei Shirota и афлатоксин (HP + LcS + AFB1), C: високо съдържание на протеини и афлатоксин (HP + AFB1). p стойности са получени от дисперсионен анализ (ANOVA). Стойностите се изразяват като средна стойност ± SD. Стойностите с различна надстрочна буква са значително различни (р 0,05) е установено при плъховете от група В в сравнение с плъховете от група С (Таблица 3). LcS, допълнен към плъховете от група В, свързва AFB1 и намалява неговата абсорбция в тънките черва [11]. Всъщност намаляването на AFM1 е около 93% в сравнение с плъховете от група В. В проучване на Nikbakht Nasrabadi et al. [14], LcS добавките причиняват 85% намаление на биомаркер на афлатоксин. Промените в хранителния прием могат да повлияят на състава на бактериите [50]. Диетата е основният фактор на околната среда, който може да повлияе на разнообразието и функционалността на бактериите [50–52]. Например, диетичният протеин влияе върху общото микробно разнообразие [53] чрез увеличаване на полезната микробиота в червата [54]. Приемът на протеини осигурява източници на азот за микробния растеж в дебелото черво [55], така че ще има достатъчно количество полезни микроорганизми, както и пробиотик LcS в група В, за да адсорбира AFB1.

Таблица 3

Концентрацията на AFM1 в урината на плъхове, индуцирани от афлатоксин.

ПараметърAFM1 (ng/ml) p стойност
Група
Б.0,39 ± 0,01 Фигура 2). Тънките черва от група А са в здраво състояние (А.1) въз основа на хистологичното наблюдение. След лечение с AFB1 в продължение на 4 седмици се наблюдава голям карцином в тънките черва на групата, лекувана с AFB1 (C.1). Подобен карцином се наблюдава в група В (В.1), но растежът на карцинома е по-малък по брой и по-малък по размер в сравнение с група С. В дебелото черво се наблюдава натрупване на лимфоцити както при третирани с AFB1 (C.2), така и при пробиотици/Третирани с AFB1 (B.2) групи. Натрупването на лимфоцити показва появата на възпаление. Растежът на карцинома обаче се открива само в групата, лекувана с AFB1 (C.2). Резултатите демонстрират негативните ефекти на AFB1 върху тънките черва и дебелото черво, докато тези ефекти могат да бъдат значително обърнати от лечението с LcS. AFB1 обикновено се свързва с рак на черния дроб. В това проучване обаче не са открити промени в оцветения с H&E черен дроб сред трите различни групи (A.3, B.3 и C.3). От друга страна, имунната дисфункция също е едно от отрицателните въздействия от замърсяването с AFB1. И все пак не се наблюдават промени в далака на всички групи (A.4, B.4 и C.4).

Оцветяване на хематоксилин и еозин на тънките черва (1), дебелото черво (2), черния дроб (3) и далака (4). A: само с високо съдържание на протеин (HP), B: с високо съдържание на протеин, Lactobacillus casei Shirota и афлатоксин B1 (HP + LcS + AFB1), C: високо съдържание на протеин и афлатоксин B1 (HP + AFB1). В тънките черва тумороподобен растеж (карцином) може да се наблюдава в група В и група В. В дебелото черво тумороподобен растеж (карцином) и натрупване на лимфоцити (възпаление) могат да се наблюдават в група В. Група В показва само натрупване на лимфоцити (възпаление). Въпреки това не са наблюдавани преобладаващи промени както в черния дроб, така и в далака. Стрелката показва тумороподобен растеж; червеният кръг показва натрупване на лимфоцити. n = 5.

4. Заключение

Като цяло, това проучване установи, че LcS има способността да свързва AFB1 след HP диета и облекчава неблагоприятния ефект на AFB1 върху телесното тегло и чернодробната и бъбречната функция. В допълнение, консумацията на LcS в диетата на HP също увеличи екскрецията на метаболита AFB1, тъй като AFM1 беше значително намален в урината. Това беше потвърдено чрез намаляване на появата на карцином в тънките черва и дебелото черво за група плъхове, хранени с AFB1 и LcS, в сравнение с тези, хранени само с AFB1. Това проучване обаче беше ограничено от липсата на нормална диетична група. Освен това са необходими по-широки изследвания, за да се определи ефектът от различния процент на протеин върху способността на LcS и други пробиотици да намалят отрицателния ефект на AFB1, тъй като това проучване е осигурило само на плъховете 40% от HP диетата. Различни макронутриенти като въглехидрати и мазнини също могат да имат ефект върху пробиотиците и метаболизма на афлатоксини и следователно налагат допълнителни проучвания за определяне на ефективността на пробиотиците като адсорбент на афлатоксин.

Благодарности

Това изследване е финансирано от Putra Research Grants от Universiti Putra Malaysia (UPM) [GP-IPS/2017/9517000 и GP-IPM/2016/9480100]. Z. Nurul Adilah и Winnie-Pui-Pui Liew са получатели на стипендия за следдипломно обучение (GRF) от School of Graduate Studies, UPM. Winnie-Pui-Pui Liew би искала да признае Министерството на висшето образование (MoHE), Малайзия, за стипендията MyBrain15.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси.

Принос на авторите

Z. Nurul Adilah и Winnie-Pui-Pui Liew проведоха експеримента, извършиха анализ на данните и написаха ръкописа. S. Mohd Redzwan и I. Amin допринесоха, като предоставиха техническа подкрепа за проекта и коригираха окончателния ръкопис.