Субекти

Резюме

Въведение

Дългосрочните висококалорични диети имат отрицателен регулаторен ефект върху здравето. Проучванията показват, че 1 висококалорична диета може да влоши състоянието на пневмония и да забави възстановяването при инфекции на дихателните пътища. Промени в ритъма на съвременния живот предизвикаха промени в структурата на чревната флора 2, като хранителен дисбаланс 3,4. Предполага се, че промените в диетичния състав могат да причинят промени във вътрешната екосистема на червата 5. Заздравяването или влошаването на дихателното възпаление също е свързано със структурата на чревната флора. Например, теорията на хипотезата за „белодробно-чревната ос“ 6 показва, че локалните възпалителни реактивни вещества на дихателната система и продуктите от метаболизма на чревната флора се обменят и стимулират чрез лимфната система и системата на кръвообращението. Все още обаче не е ясно дали приемът на висококалорична диета влошава възпалителния отговор на дихателните пътища, повлиян от чревната флора. Това проучване изследва потенциалното влияние на висококалоричната диета върху влошаващите пневмония плъхове в чревната флора.

Материали и методи

Животни и реактиви

Животни: SD плъхове с чист клас, 40, мъжки, на 4 седмици, с тегло 110 g ± 10 g. Сертификат за животни №: 11401500016361, предоставен от Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., лиценз №: SCXK (Jing) 2016-0002. Съхранява се в лаборатория за животни от Института по традиционна китайска медицина, Пекински университет на китайската медицина със свободен достъп до храна и вода, естествена светлина.

Всички експерименти с животни в това проучване са проведени в съответствие със съответните насоки и разпоредби и одобрени от Комитета за преглед на етиката на животните към Пекинския университет по традиционна китайска медицина с номер на одобрение (Animal Laboratory Ethics Examination Number): BUCM-4-20170901 -3034.

Домашни фуражи: според съотношението на гювеча, шоколадовата вафла, телешкото зърно и брашното 1: 2: 2: 1, формата е същата като обикновените фуражи, а Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. отговаря за стандартното производство и контрол на качеството, вижте Таблица 1.

Реагенти: Мотилин ELISA Kit (Wuhan Huamei, CSB-E08208r), Gastrin ELISA Kit (Wuhan Huamei, CSB-E12743r), Комплект за детектиране на еднофакторни плъхове (Rat IL-6), Комплект за откриване на еднофакторни плъхове (Rat TNF-α), GRO alpha/KC/CINC1, IL-12 p40, Основен комплект за мишка/плъх, първично антитяло NF-κB (CST, 8242), MyD88 (Abeam, ab2064), MD2 (Abcam, ab24182), β-актин (CST, 4970 S), спомагателен реагент на вторично антитяло 042-206.

Хранене на животни и събиране на материали

Откриване на знак

Всяка сутрин, преди да бъде извършен моделът (взети са материали), плъховете се претеглят като данни за теглото за този ден. Естественият периметър на талията на плъха е нейната обиколка. Температурата на аксиларната и ректалната част на левия преден крайник на плъх беше измерена с инфрачервен температурен инструмент. Вземете съотношение на определено тегло на органи към телесно тегло на плъхове, т.е. съотношението орган-тяло. Формулата е:

Тестване на тъкан

Напречните разрези на чревната тъкан и белодробната тъкан се приготвят съгласно рутинната процедура за приготвяне на оцветяване на тъканен восък с блок-резен-HE. Серумният мотилин и гастрин бяха открити по метода ELISA; серумните възпалителни фактори се третират с метод Aimplex съгласно инструкциите на реагента. Използвайки проста западна техника, първо се открива съдържанието на протеин в пробата, а след това се симулира западна лента.

Откриване на микроекологични в чревното съдържимо

Първо се открива микробната ДНК последователност в пробата; Класификацията на OTU и нивото на биологична класификация бяха идентифицирани според базата данни. Според резултата от групирането се извършва клъстерен анализ и анализ на групови разлики и се изготвят съответни статистически диаграми. И накрая, въз основа на резултатите от възпалителните фактори беше извършен корелационен анализ между флората и възпалението и беше извършен анализ на пътя на анотирането на функцията на флората.

Изследвания на биоинформатиката

Първо, в Polysearch2 (http://polysearch.cs.ualberta.ca/) изберете „Дадено“ като „Текст“, „Намери всички свързани“ като „Гени/протеини“ и въведете „Висока калория“ в Query Keyword, и щракнете върху „Бързо търсене“ и запазете резултата; въведете „Pneumoniia“ в Query Keyword и щракнете върху „Бързо търсене“ и запазете резултата. За да комбинирате висококалорични гени с пневмония, щракнете върху „търсене“ в низ (https://string-db.org/) и изберете „Множество протеини“ вляво и въведете гена за консенсус в списъка с имена и щракнете върху „Търси“ и „продължи“, получи взаимодействие с протеини. Таблицата на връзките е импортирана в Cytoscape (V3.6.0), а приставката “MCODE” е използвана за анализ на мрежата за взаимодействие с протеини. В базата данни David (V6.7) (https://david-d.ncifcrf.gov/) щракнете върху „Стартиране на анализ“, за да въведете в списъка генна последователност на основната мрежа от MCODE анализ и изберете „office gen symbol“ и „ Списък на гените “и щракнете върху„ Изпращане на списък “. Изберете вид „homo sapiens“ и щракнете върху „Функционална диаграма на анотациите“, изчакайте малко и изберете KEGG_PATHWAY в Pathways, за да анализирате обогатяването на пътя.

Резултати

Общо положение на животните

По време на експеримента общото тегло на четири групи плъхове показва нарастваща тенденция. В сравнение с NC групата, телесното тегло на MC3 групата намалява след висококалорична диета и разликата е статистически значима. След атомизиране телесното тегло на MC1 и MC2 се увеличава, а на MC3 намалява, разликата е статистически значима (Фиг. 1А). В сравнение с NC групата, след висококалорична диета, коремната обиколка на всяка група не е неравномерна, разликата е статистически значима. След атомизиране, коремната обиколка на MC2 групата се увеличава, а коремната обиколка на MC3 групата намалява. Разликата е статистически значима (фиг. 1В). В сравнение с NC групата, няма значителна разлика в ректалната температура между групите след висококалорична диета. Аксиларната температура във всяка група е неравна и разликата е статистически значима. След пулверизацията ректалната температура в групата MC3 намалява и разликата е статистически значима (Фиг. 1В, С). След експеримента белодробният коефициент на тегло на групата MC2 и MC3 се увеличи и разликата беше статистически значима (P Фигура 1

диета

Промени във физическите признаци на плъхове с висококалорична храна и пневмония. (A) Тегло, (Б.) коремна обиколка, (° С) ректална температура, (д) аксиларна температура, (Е.) органен коефициент, (F) бял дроб.

Възпалителни фактори на серума и рецепторен протеин за разпознаване на чревния модел

Промени в тъканите на плъхове с висококалорична храна и пневмония. (A) HE оцветяване на червата и белите дробове; (Б.) серумен мотилин, гастрин; (° С) серумен възпалителен фактор; (д) рецептор за разпознаване на протеиновия път в чревната тъкан. Отляво надясно: NC, MC1, MC2, MC3.

След експеримента, гастринът е неравен във всяка група и разликата е статистически значима (фиг. 2Б); Kc във всяка група е неравномерна и разликата е статистически значима (Фиг. 2С). В сравнение с NC групата, експресията на MD2 е намалена в MC2 групата; в сравнение с групата MC1, експресията на TLR9 се увеличава в групата MC3 и разликата е статистически значима (Фиг. 2D).

Структура на чревната флора

Извършихме 40 последователни проби на базата на платформата Illumina MiSeq и дължината на последователността беше разпределена главно в диапазона 400-500 bp (Фиг. 3А). Резултатите от графика на Venn показват, че четири групи имат общо 1926 OTU. Сред които има 109 в NC група, 106 в MC1 група, 93 в MC2 група и 60 в MC3 група (Фиг. 3B). Кривите на разреждане, натрупване на видове и криви на регистрация на изобилие са склонни да бъдат стабилни, което показва, че текущите резултати са достатъчни, за да отразят разнообразието на настоящата проба и средната степен е достатъчно висока (Фиг. 3C, E).

OTU разделяне на микроекологията на чревното съдържание. (A) Разпределение на дължината на последователността; (Б.) Диаграма на Venn на споделена OTU; (° С) оскъдна крива на OTU номер; (д) крива на натрупване на видове specaccum; (Е.) крива на степента на изобилие; (F) статистика на микробния брой за всяко ниво на класификация.

Микроекологична структура на чревното съдържимо. (A) Карта за показване на единица за класификация на разликите между групи, базирана на дървото на ниво на класификация (NC-MC1); (Б.) групова към групова разлика единица за класификация показва карта, базирана на дърво на ниво класификация (NC-MC2); (° С) групова към групова разлика единица за класификация показва карта, базирана на дърво на ниво класификация (NC-MC3); (д) карта за показване на единица за класификация на разликата от група към група въз основа на дървото на ниво на класификация (MC1-MC3); (Е.) групова към групова разлика, класификационна единица за показване на карта въз основа на дървото на ниво на класификация (MC2-MC3); (F) обща дървовидна диаграма на ниво класификация въз основа на проба GrabhlAn.

Анализът на основните компоненти на PCA показа, че структурата на разпределение на MC2 и NC групите в космоса е по-близка; докато MC3 и MC1 е разпределение на тенденцията в различни посоки (фиг. 5А). Анализът на главните координати на PCoA показа онази разлика между пробите, които водеха MC3 и MC1 да се дискретират под различни ъгли (Unigighted UniFrac, Фиг. 5B); MC3 е по-дисперсионна (претеглена UniFrac, фиг. 5C). Анализът на дискриминацията на частичните най-малки квадрати PLS-DA показа, че съвпадащата част от NC групата и MC1 групата е по-голяма от тази на независимата част; част от съвпадението на NC група, MC2 група и MC3 група е по-малка от тази на независимата част; част от съвпаденията на група MC1 и група MC3 е по-малка от тази на независимата част; част от съвпадението на група MC2 и група MC3 е по-малка от тази на независимата част, което предполага, че моделът на класификация работи добре (Фиг. 5D).

Микроекологични фактори на чревното съдържимо. (A) Триизмерни проби от сортиращи карти от PCA анализ; (Б.) триизмерни проби от сортиращи карти от нетеглен анализ на UniFrac PCoA; (° С) триизмерни проби от сортиращи карти от претегления анализ на UniFrac PCoA; (д) PLS-DA диаграма на дискриминантния анализ; (Е.) Диаграма за сортиране на ограничения за RDA; (F) свързана мрежова диаграма на доминиращ род.

Имайки предвид ефектите на факторите на околната среда върху връзките между гостоприемника и флората, това проучване установи, че IL-12 и IL8 са значително по-мощни от IL-6 и TNF-α. Сред които TNF-a-IL-6 и IL-6-IL8 имат положителна корелация; TNF-α-IL8, TNF-α-IL-12, IL-6-IL-12 и IL8-IL-12 са в отрицателна корелация. MC1 и MC3 са в положителна корелация с плъх KC и IL-6, докато отрицателно корелират с IL-12 и TNF-α. MC2 корелира отрицателно с плъх KC и IL-6 и положително корелира с IL-12 и TNF-α (фиг. 5Е). Освен това е установено, че има отрицателна корелация между Lactobacillus-Dorea и Lactobacillus-Ruminococcus в асоциирана мрежа от 50-те най-големи количества и доминиращия род с rho> 0,6 и стойност P

Предсказване на метаболитната функция на чревното съдържимо. (A) Предвидена схема за разпределение на второ ниво на KEGG от KERUSt; (Б.) Карта на Venn на обща функционална група; C: Топлинна карта на изобилието на ортологичен генетичен клъстер (KO) в комбинация с анализ на клъстери.

Изграждане на биологична мрежа

Това проучване установи, че премахването на дублирани сред 14 гена, свързани с „Висока калоричност“ и 22 гена, свързани с „Пневмония“ (вж. Допълнителни данни), са 35 гена, които включват 56 групи протеинови взаимодействия (Фиг. 7А). След групирането се получи група клъстери (фиг. 7Б). След обогатяване бяха получени два свързани пътя, а именно чревна имунна мрежа за производство на IgA и NOD-подобен рецепторен сигнален път (Фиг. 7C, D).

Патологично изграждане на биологична мрежа на висококалорична диета, съчетана с пневмония. (A) Взаимодействие с протеини въз основа на струнен анализ; (Б.) клъстер, базиран на анализ на mcode (резултат = 6,75, обогатяването е пропорционално на засенчването на възела); (° С) Резултат от обогатяване на чревна имунна мрежа за път на производство на IgA (червената звезда е обогатяващ протеин, степента на обогатяване с протеини е обратно пропорционална на цветния нюанс); (д) Резултати от обогатяване на NOD-подобен сигнален път на рецептора (червената звезда е обогатяващ протеин, степента на обогатяване с протеини е обратно пропорционална на цветния нюанс).

Дискусия

Детската пневмония е често срещано заболяване в дихателната система на децата с висока честота. Дори е една от важните причини за детска и детска смърт в някои райони 7,8,9. С промените в социалния прогрес и навиците на живот лошите хранителни навици се превърнаха в една от важните причини за заболявания като респираторни инфекции.

Дали висококалоричната диета влияе върху инфекциите на дихателните пътища чрез чревната флора.

Чревната флора засяга системния имунитет на гостоприемника, като променящата се микробна популационна структура на местната среда, която може да повлияе на имунната функция на дисталните органи. Abt M C и др. 21 посочи, че вродените антивирусни и адаптивни имунни отговори на мишките с дисбактериоза са били нарушени и времето за изчистване на вируса след грипна вирусна инфекция е удължено. Експресия на мишки с дефицит на макрофаги на интерферони от тип I и тип II намалява способността да ограничава вирусната репликация. Schuijt TJ и др. 22 установи, че мишките C57BL/6 след отстраняване на чревната флора се разпространяват по-бързо, придружени от тежко възпаление и органна недостатъчност и повишена смъртност след инфекция със Streptococcus pneumoniae и отслабват поглъщането на алвеоларни макрофаги и намален отговор на липополизахарид. Предполага се, че чревната флора може да бъде защитен фактор за гостоприемника да се противопостави на пневмококова болест.

Животът е сложна и динамична система. Трудно е да се контролират глобални или основни механизми чрез използване на традиционни биомедицински методи за изследване за количествено или качествено изследване на определен патологичен процес. Биоинформатика и други биологични мрежи, като чревна имунна мрежа за производство на IgA и NOD-подобни рецепторни сигнални пътища, представени в това проучване, които могат да бъдат важни патологични механизми за висококалорична диета, комбинирана с пневмония. Все пак трябва да се провери чрез експерименти. Освен това някои допълнителни традиционни лекарства, като китайската медицина, имат уникални идеи за лечение на свързани заболявания. Проспективно кохортно проучване, основаващо се на теорията за TCM 23, показва, че децата със стомашно-чревна топлина могат да бъдат по-податливи на респираторни инфекции, където сухотата на изпражненията и индексът на телесна маса са положително/отрицателно свързани с рецидивиращи респираторни инфекции. Връзката между диференциращата система на синдрома на топлинния синдром в китайската медицина и структурата на диетата и въздействието върху инфекцията на дихателните пътища може да се използва като входна точка или точка на пробив за по-нататъшни изследвания.

В обобщение, микроекологичното изследване на висококалоричен диетичен модел на пневмония е първият доклад за микроекологично проучване на пневмония и черва, базирано на диетични фактори. С оглед на сложността на хранителната структура, причинена от различни региони, раси, пол, начин на живот и др., Това проучване постави основата за по-нататъшно проучване на ефектите от диетата върху инфекции на дихателните пътища и горещо изследване на чревната флора като патогенеза/терапевтична цел. Междувременно е от голямо значение за по-нататъшни изследвания за подобряване на диетичната структура и заместване на антибиотиците за инфекция.