Антонио Дж. Мелендес-Мартинес

1 Лаборатория по хранене и ракова биология, Jean Mayer USDA Център за изследване на човешкото хранене по въпросите на стареенето към Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс, САЩ;

2 Департамент по хранене и хранителни науки, Университет на Севиля, 41012 Севиля, Испания;

Андре Ф. Насименто

1 Лаборатория по хранене и ракова биология, Jean Mayer USDA Център за изследване на човешкото хранене по въпросите на стареенето към Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс, САЩ;

3 Клинична катедра по медицина, Медицинско училище в Ботукату, Държавен университет в Сао Пауло, Ботукату, Сао Пауло, Бразилия;

Ян Уанг

1 Лаборатория по хранене и ракова биология, Jean Mayer USDA Център за изследване на човешкото хранене по въпросите на стареенето към Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс, САЩ;

Чун Лю

1 Лаборатория по хранене и ракова биология, Jean Mayer USDA Център за изследване на човешкото хранене по въпросите на стареенето към Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс, САЩ;

Илей Мао

4 Катедра по чернодробна хирургия, Пекинския медицински колеж, Пекин 100032, Китай

Сян-Донг Уанг

1 Лаборатория по хранене и ракова биология, Jean Mayer USDA Център за изследване на човешкото хранене по въпросите на стареенето към Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс, САЩ;

Резюме

Въведение

Каротеноидите, изопреноидни съединения, участващи в безброй природни функции (1), продължават да привличат голям интерес поради натрупване на доказателства, сочещи, че някои от тях - техните метаболити и/или свързани съединения участват в различни биологични функции в човешкото тяло и осигуряват разнообразно здраве Ползи. По-конкретно, ползите за здравето от ликопен (LY, ψ, ψ-каротин, Фигура 1), червеният пигмент, открит в някои растителни храни (домати, диня, грейпфрут и други плодове) и на неговите окислителни метаболити са обект на основни изследвания през последното десетилетие (2).

екстракт

Химическа структура на ликопен, фитоен и фитофлуен

В едно от най-ранните проучвания за връзките между каротеноидите и профилактиката на канцерогенезата, PT изглежда намалява броя на UV-B индуцираните кожни тумори при мишки по отношение на контролите (13). Доказано е, че PTF инхибира растежа на HL-60 човешки промиелоцитни левкемични клетки след 5 дни лечение с около 23% (14) и LY, PT, PTF и β-каротин могат да инхибират пролиферацията на раковите клетки, индуцирана от някои естрогени, които са най-важните рискови фактори при рак на млечната жлеза и ендометриума (15). Наскоро демонстрирахме, че доматеният екстракт, в сравнение с LY, показва по-голяма ефективност в защитата срещу индуцирано възпаление на черния дроб с високо съдържание на мазнини (HFD) чрез намаляване както на броя на възпалителните огнища, така и на експресията на множество възпалителни цитокини (16). Имайки предвид натрупващите се доказателства, че PT и PTF могат да бъдат биоактивни съединения (5) и във връзка с други експерименти (16,17), в това проучване изследвахме PT, PTF, LY, липидни профили и холестерол при плъхове, хранени с контролна диета (CD ) или HFD с или без добавка на ТЕ във връзка с чернодробно възпаление и липидни профили, свързани с диета с високо съдържание на мазнини, и канцерогенеза.

Материали и методи

Животни, диети и групи

Поддържането и отглеждането на плъхове е описано другаде (18). Накратко, осемседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (Charles River Co., Wilmington, MA) са били хранени или с контролна диета на Lieber-DeCarli (CD, 35% енергия от мазнини), или с HFD (71% енергия от мазнини) (Dyets Inc., Витлеем, Пенсилвания) ad libitum за 6 седмици. Всички плъхове бяха разпределени на случаен принцип в 4 групи (n = 8): (I) CD; (II) CD + TE; (III) HFD и (IV) HFD + TE. Диетичният прием се следи ежедневно и телесното тегло се измерва ежеседмично. В края на този експеримент плазмата се събира чрез сърдечна пункция, докато черният дроб се изрязва и замразява в течен азот и се съхранява при –80 ° C. Институционалният комитет за грижи и употреба на животните към Центъра за изследване на човешкото хранене на USDA за остаряване одобри протокола за животните.

Хранителни добавки

TE беше любезно предоставена от LycoRed Ltd. (Beer-Sheva, Израел). Според производителя се съдържа

1,5% естествени токофероли,

0,2% бета-каротин. Дозировката на TE (250 mg TE/kg BW на ден) е избрана да съдържа еквивалентно количество LY на това от използвания чист LY (15 mg LY/kg BW на ден). TE добавките за всяка група бяха претеглени и хомогенизирани с течна диета, за която беше доказано, че се консумира достатъчно от плъхове от предишните ни проучвания. Диетите се приготвят два пъти седмично и се съхраняват при –4 ° C в непрозрачни бутилки, за да се предотврати разграждането на каротеноидите.

HPLC анализ

Хистологично изследване на възпалителни огнища и имунохистохимичен анализ

Чернодробните тъкани, фиксирани с формалин и вложени в парафин, се обработват рутинно за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E). Броят на чернодробните лобуларни възпалителни огнища се отчита при 20-кратно увеличение от 10 произволно избрани полета под светлинен микроскоп от двама независими изследователи, както беше описано по-рано. Средният брой на огнищата за всяка група беше определен и след това сравнен. AHF експресиращи P-GST бяха открити и анализирани чрез имунохистохимичен анализ, както е описано по-горе (16,19).

Биохимичен анализ за липиди

Липидите се екстрахират, като се използва смес хлороформ: метанол (2: 1, v/v) съгласно рутинни процедури. След това бяха използвани налични в търговската мрежа комплекти за измерване на общия триглицерид (TG) (кат. No: 10010303, Cayman Chemical Inc, MI), общия холестерол (TC) (кат. №: TE289, Wako Chemical Inc, VA) и свободните мастни киселини ( FFA) (Кат. №: K612-100, Biovision Inc, Калифорния).

Експресия на гени чрез PCR в реално време

Общата РНК беше изолирана от черния дроб чрез изолиращ реагент TriPure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) съгласно инструкциите. След това се приготвя cDNA от пробите на РНК, използвайки M-MLV обратна транскриптаза (Invitrogen, Carlsbad, CA) и автоматизиран термичен циклер (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). След количествено определяне и квалификация, PCR реакциите за амплифициране на сДНК, представляващи интерес, се провеждат, като се използва 20 µL реакционна смес, съдържаща 10 µL 2X SYBR Green Supermix, 0,4 µL от 10 µmol/L праймерна смес (включително праймери и обратни праймери) и 2,5 µL cDNA, разредена в вода без RNase. Условията за колоездене бяха 50 ° С за 2 минути и 95 ° С за 10 минути, последвани от 40 цикъла при 95 ° С за 15 секунди и 60 ° С за 1 минута. Специфичните за гена последователности от праймери са проектирани с помощта на софтуера Primer Express версия 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Резултатите от PCR след това се нормализират до нивата на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) и се изчисляват чрез позоваване на средната стойност за контролната група, използвайки сравнителния Ct метод. За всяка проба и всеки ген, PCR реакциите се провеждат в два екземпляра и се повтарят два пъти. Двойките праймери, използвани за PCR анализ в реално време, са описани в Таблица 1 .

маса 1

Sense Анти-смисъл
ACC1 5'-TTCTTGGAACTGAACCCTCGG-3 ' 5'-ATCCCCATGGCAATCTGGAG-3 '
CD36 5'-TGGTGGATGGTTTCCTAGCCTT-3 ' 5'- CGTGGCCCGGTTCTACTAATTC-3 '
CPT-1 5'-TCATCCGGTTCAAGAATGGC-3 ' 5'-TCTTTGCGATCATGCCCAG-3 '
DGAT2 5'-CCTGCAGTGTCATCCTCATGTA-3 ' 5'-TGATCTCCTGCCACCTTTCTT-3 '
FAS 5'-TGGATCCATGGCAGCTGTTG-3 ' 5'-TCATTCACTGCAGCCTGAGGTC-3 '
PPARγ 5'-CGGTTGATTTCTCCAGCATT-3 ' 5'-AGCAAGGCACTTCTGAAACC-3 '
SREBP-1c 5'-GCCTTGCACTTCTTGACACG-3 ' 5'-GTCCCCATCCACGAAGAAAC-3 '

Статистически анализ

Анализ с високоефективна течна хроматография (HPLC), съответстващ на доматния екстракт, използван за добавките, показващ пиковете и спектрите (вложка), съответстващи на ликопен (472 nm), фитоен (285 nm) и фитофлуен (350 nm) изомери

Нива на каротеноиди в чернодробни проби (µg/g) (A) и плазма (µg/L) (B) както в контролната диета (35% мазнини като общ енергиен прием), така и в диетата с високо съдържание на мазнини (71% мазнини като общ енергиен прием) с добавка от доматен екстракт (TE). Не са открити каротеноиди както в CD, така и в HFD групи без добавяне на TE (данните не са показани)

Плазмени и чернодробни липидни нива

Таблица 3

CDCD + TEHFDHFD + TE
Плазма
Триглицерол (mmol/L)0,5 ± 0,10,7 ± 0,30,6 ± 0,10,5 ± 0,1
Общ холестерол (mmol/L)1,0 ± 0,10,7 ± 0,1 *1,2 ± 0,1 **0,9 ± 0,1 *
Свободна мастна киселина (mmol/L)0,4 ± 0,10,3 ± 0,10,6 ± 0,10,6 ± 0,2
Черен дроб
Триглицерол (µmol/g тъкан)8,7 ± 1,311,9 ± 3,2 *15,7 ± 1,4 **28,4 ± 3,0 *
Общ холестерол (µmol/g тъкан)2,5 ± 0,45,1 ± 0,6 *4,1 ± 0,5 **7,8 ± 0,7 *
Свободна мастна киселина (µmol/g тъкан)0,7 ± 0,10,7 ± 0,11,0 ± 0,1 **1,5 ± 0,2 *

Относителни нива на иРНК на ключови рецептори, ензими и транскрипционни фактори на липидния метаболизъм в черния дроб на плъхове с различни лечения. Символи, показващи значителна разлика при P Фигура 5). Във всеки случай, нивата на иРНК на (ACC) -1 са значително по-високи при плъхове, получаващи HFD, в сравнение с тези, получаващи CD (Фигура 5). Тези наблюдения изглежда показват, че ТЕ благоприятства чернодробната липогенеза при плъхове, получаващи нормални диети, но не и при тези, които получават диети с високо съдържание на мазнини.

Диацилглицерол ацилтрансферазата (DGAT) катализира превръщането на диацилглицеролите в триацилглицероли, последният етап от биосинтеза на последните съединения. Има няколко изоформи на ензима с различни каталитични свойства, тъканно разпределение, субклетъчна локализация и физиологични функции. В нашия модел добавката с TE доведе до значително повишаване на нивата на mRNA (DGAT) -2 както при CD, така и при плъхове, хранени с HFD (Фигура 5). Количеството мазнини в диетата на плъхове, които не получават добавки, не оказва значително влияние върху нивата на иРНК.

Карнитин палмитоилтрансферазата (CPT) -1 е ензим със съществена роля в окисляването на мастните киселини в митохондриите на тъканите на бозайници. В нашия модел на плъхове, ние забелязахме, че добавянето с TE не повлиява значително нивата на mRNA на този ензим в CD групата, въпреки че ги намалява в HFD-групата. По същия начин се наблюдава значителна индукция на транскрипцията на (CPT) -1 гена при HFD плъхове спрямо CD плъхове (Фигура 5).

Рецепторите, активирани с пролифератор на пероксизома (PPAR), разположени в ядрата, играят ключова роля в липидния метаболизъм, клетъчната диференциация и възпаление и други процеси. Описани са три подтипа PPAR (α, γ и δ) с различни модели на експресия и функции. Най-интензивно изследваната изоформа е PPARγ, която се експресира предимно в червата и мастната тъкан, наред с други функции, насърчава съхранението на липидите. Свързващите протеини на стерол-регулаторните елементи (SREBP) са мембранно свързани транскрипционни фактори, които регулират липогенни и гликолитични гени, включително ключови гени, участващи в метаболизма на холестерола. Три членове на семейството SREBP са описани при бозайници, а именно SREBP-1a, -1c и -2. В нашето проучване нивата на PPARy mRNA са значително по-високи при плъховете, получаващи HFD, спрямо контролата, докато добавката TE води до значително увеличаване на транскрипта само в случая на CD + TE групата. За разлика от това, количеството мазнини в групите, които не получават ТЕ, не повлиява значително транскрипцията на SREBP-1, докато добавката води до повишаване на нивата на иРНК на този транскрипционен фактор само при плъхове, получаващи HFD (Фигура 5).

Дискусия

Една от нашите по-интригуващи констатации от това проучване е значителното повишаване на регулирането, вместо понижаване, на почти всички чернодробни липидни профили чрез хранително добавяне на ТЕ при плъхове, хранени с CD или HFD. Повишаването на регулирането на чернодробните липидни профили изглежда не зависи от диетата и чрез различни механизми. При плъхове, хранени с CD, добавянето на TE води до повишено усвояване на FFA, липогенеза и синтез на TG чрез неговото регулиране върху чернодробните CD36, ACC1 и DGAT2. От друга страна, при плъхове, хранени с HFD, CD36 е увеличен, докато DGAT2 е значително по-нисък от CPT-1, което предполага, че промененото липидно окисление също може да бъде включено в този процес. Повишеното регулиране на притока на липиди при плъхове, хранени с CD, също може да бъде повлияно от повишен PPARγ, който е значително индуциран при CD плюс TE спрямо CD и е посочено, че е основен транскрипционен фактор в хепатоцитите за подобряване както на липидния синтез, така и на натрупването, което води до стеатоза. Установено е обаче, че SREBP-1c, друг ключов транскрипционен фактор, регулиращ липогенезата, е силно индуциран в HFD плюс TE, но не и в CD плюс TE групата. Трябва да се проведат повече проучвания, за да се потвърдят нашите констатации, за да се гарантира дали този ефект е специфичен само за различна мастна диета, животински видове или дозировка на домати каротеноиди.

Данните относно транскрипцията на ключови ензими, участващи в липидния метаболизъм, сочат към факта, че количеството мазнини в диетата на недопълнени плъхове благоприятства липогенезата и окисляването на мастните киселини в черния дроб, но няма значителен ефект при синтеза триацеилглицероли. Ефектите от добавката на ТЕ са последователни само в случая на DGAT и изглежда благоприятстват синтеза на триацеилглицероли независимо от вида на получената диета. За разлика от това, добавката благоприятства липогенезата само при плъхове, получаващи CD и митохондриалното окисление на мастни киселини в групата, получаваща HFD. Като цяло може да се заключи, че богатият на каротеноиди ТЕ не само инхибира индуцираното от HFD възпаление и насърчава чернодробната канцерогенеза, но също така влияе по различен начин на транскрипцията на ензимите, участващи в липидния метаболизъм, в зависимост от количеството мазнини, осигурени в диетата. Освен това изглежда, че ТЕ има роля в транскрипционната регулация от PPARγ и SREBP-1c на експресията на гени, свързани с липидния метаболизъм, както при плъхове, получаващи CD и HFD.

Благодарности

Тази работа беше съвместна изследователска програма, подкрепена от гранта на NIH R01CA104932; Грант на USDA 1950-51000-064S; A.J. Мелендес-Мартинес признава финансирането чрез испанските програми Ramón y Cajal и Националната програма за мобилност на човешките ресурси, референции. RYC-2010-07115 и JC-2009-00176. Благодарността на Connie Hu и Jun-Goo Kwak е признателна.

Разкриване: Авторите не декларират конфликт на интереси.