Дейвид Кадош

отдел по микробиология, имунология и молекулярна генетика, Университет в Тексас, Научен център за здраве в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Лора К. Найвар

b Катедра по медицина, Отдел по инфекциозни болести, Университет на Тексас, Научен център за здраве в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

d Здравна система на ветераните от Южен Тексас, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Роузи Боканегра

b Катедра по медицина, Отдел по инфекциозни болести, Университет на Тексас, Научен център по здравеопазване в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

d Здравна система на ветераните от Южен Тексас, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Маркос Оливо

b Катедра по медицина, Отдел по инфекциозни болести, Университет на Тексас, Научен център за здраве в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Уилям Р. Къркпатрик

b Катедра по медицина, Отдел по инфекциозни болести, Университет на Тексас, Научен център за здраве в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

d Здравна система на ветераните от Южен Тексас, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Нейтън П. Видерхолд

c Катедра по патология, Лаборатория за изследване на гъбички, Университет на Тексас, Научен център за здраве в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Томас Ф. Патерсън

b Катедра по медицина, Отдел по инфекциозни болести, Университет на Тексас, Научен център за здраве в Сан Антонио, Сан Антонио, Тексас, САЩ

d Здравна система на ветераните от Южен Тексас, Сан Антонио, Тексас, САЩ

Свързани данни

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Candida albicans, най-често изолираният човешки гъбичен патоген, представлява около 50% от случаите на кандидоза и може да причини широк спектър както на лигавични, така и на животозастрашаващи системни инфекции (1, 2). Имунокомпрометираните лица, включително пациенти с ХИВ/СПИН, получатели на протези, пациенти с рак и реципиенти на трансплантирани органи, са особено уязвими към инфекция (3, –6). Около 70% от пациентите със солиден тумор развиват инфекции с Candida, много от които са получили химиотерапия и/или са претърпели операция през месеца преди инфекцията (7). Кандидозата също е основна причина за смърт сред пациентите с левкемия (7, 8). Приблизително 1 милиард долара се изразходват годишно за лечение на пациенти с болнични инфекции Candida само в САЩ (9).

Установени са и редица модели за коменсална колонизация на стомашно-чревния тракт от C. albicans (16, 26, –31). Инокулацията обикновено се извършва чрез орална сонда, а колонизацията се следи чрез определяне на гъбичната тежест във фекалните пелети в различни точки на постинокулация. Няколко от тези модели са били много полезни при характеризирането на транскрипционни регулатори, като Efh1 и Sfu1, които участват в контрола на нивото на колонизация на C. albicans GI в отговор на екологичните сигнали на приемника. Едно ограничение на тези модели обаче е, че антибиотиците, които могат да окажат влияние върху нивото и състава на естествената бактериална флора, се използват за постигане на колонизация на C. albicans.

За да се справят с този проблем, Yamaguchi et al. описва GI модел на мишка, който използва пречистена диета, състояща се от царевично нишесте, казеин, захароза, соево масло, целулоза, 1-цистин, холин битартрат, както и витаминни и минерални смеси, а не стандартна търговска диета (32). Пречистената диета води до намалени нива на лактобацили в червата, както и до намаляване на органичните киселини, които тези бактерии произвеждат. На свой ред органичните киселини от своя страна показват, че по-рано инхибират растежа на C. albicans. В допълнение, предишно проучване предполага, че диетичните храни за гризачи съдържат вещества, които неутрализират токсичността на мастните киселини срещу лактобацилите (33), като по този начин повишават нивата на тези бактерии (и най-вероятно повишават и нивата на органични киселини в червата). По този начин пречистената диета улеснява първоначалната колонизация на C. albicans на стомашно-чревния тракт без допълнителни усложнения от употребата на антибиотици.

В това проучване ние модифицираме диетичния подход, описан по-горе, за да разработим нов модел на мишка, който може да бъде специално използван за изследване на дисеминирана кандидоза, придобита чрез стомашно-чревния тракт. Ние демонстрираме, че нашият модел може да оцени както смъртността, така и колонизацията на стомашно-чревния тракт, както и разпространението на гъбички в различни системни органи при имуносупресия. Най-важното е, че ние показваме, че този модел може да се използва за определяне на ефикасността на множество противогъбични средства за спиране на разпространението на C. albicans от стомашно-чревния тракт.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Щам.

C. albicans SC5314 беше щамът, използван в това проучване, което беше описано по-рано (34). Използвахме щам SC5314, тъй като той е най-често използваният щам C. albicans от див тип и референтният щам, от който са получени повечето други щамове C. albicans, което позволява по-добро сравнение на нашите резултати с тези от други проучвания. В допълнение, вирулентността на този щам е била оценена в многобройни предишни проучвания (11, 35, 36). C. albicans SC5314 е изпъстрен от глицеринов запас при -80 ° C и е отглеждан върху плаки с екстракт от дрожди-пептон-декстроза (YEPD) при 30 ° C в продължение на 2 дни. След това клетките бяха използвани за инокулиране на 50 ml YEPD течна среда и културата беше отгледана за една нощ (~ 16 до 24 часа) при 200 rpm в 30 ° C инкубатор преди приготвяне на инокулат.

Диетичен миши модел GI на дисеминирана кандидоза. (i) Анализ на разпространението.

(ii) Анализ за оцеляване.

Експериментите за оцеляване се извършват по начин, идентичен с този за описаните по-горе експерименти за разпространение, като се използва инокулум от клетки 4,2 × 10 7 C. albicans, със следните изключения: (i) четири дози от лечението с имуносупресия, всяка състояща се от 150 mg/kg циклофосфамид (ip) и 65 mg/kg преднизолон (sc), са прилагани на 14, 17, 21 и 24 ден след инфекцията, и (ii) оцеляването се наблюдава в продължение на 30 дни и всички оцелели мишки са жертвани на ден 30. Гъбичните тежести в черния дроб, бъбреците, далаците, горските махи и тънките черва бяха оценени, както е описано по-горе за анализа на разпространението.

Този протокол за животни е одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Университета на Тексас в Научния център по здравеопазване в Сан Антонио и всички животни се поддържат в съответствие с Асоциацията за оценка и акредитация на лабораторни грижи за животните.

РЕЗУЛТАТИ

Създаване на диетичен модел на мишка за дисеминирана кандидоза, придобит чрез стомашно-чревния тракт.

противогъбичното

Схема на диетични модели за кандидоза, придобити чрез стомашно-чревния тракт. (А) Контур на модела, използван за оценка на разпространението на C. albicans от стомашно-чревния тракт. Мишките бяха поставени на пречистена диета AIN-93G в продължение на 2 седмици и след това бяха инокулирани чрез орален сондаж (интрагастрална инокулация [напр.]) С див тип щам C. albicans. След допълнителни 2 седмици на една група мишки се прилагат две дози имуносупресивно лечение, а на втора контролна група не се прилага имуносупресия. Всички мишки бяха умъртвени на 21 ден след инфектиране и бяха взети както стомашно-чревни, така и системни органи за анализ на гъбичната тежест. (Б) Контур на модела, използван за оценка на оцеляването в отговор на стомашно-чревното разпространение на C. albicans. Следва се протокол, подобен на описания по-горе за панел А, с изключение на това, че на мишките се прилагат четири дози имуносупресивно лечение и се следи за оцеляване в продължение на 30 дни. Всички оцелели мишки бяха умъртвени на ден 30. FLU, 5 mg/kg флуконазол (i.p.); CSP, 1 mg/kg каспофунгин (i.p.); Цикло, 150 mg/kg циклофосфамид (i.p.); Преди сук, 50 mg/kg преднизолон натриев сукцинат (Solu-Delta-Cortef) (s.c.); Pred, 65 mg/kg преднизолон (s.c.); предварително, предимуносупресия; пост, постимуносупресия; D0, ден 0.

Флуконазол и каспофунгин инхибират разпространението на C. albicans от стомашно-чревния тракт на имунокомпрометиран гостоприемник. Мишките бяха заразени с 6 × 10 7 клетки от див тип щам C. albicans, администрирани противогъбични средства, имуносупресирани и умъртвени, както е описано в легендата на фиг. 1А. (А) Средно гъбично натоварване (± стандартни грешки на средствата) в изпражненията на посочените групи мишки, взети в показаните часови точки. (Б) Гъбична тежест в стомашно-чревните органи от посочените групи мишки, жертвани в посочените часови точки (стълбовете показват медиани) (n = 5 [заразени групи на ден 14 или ден 21] или n = 10 [всички други групи]). (C) Гъбична тежест в системни органи от посочените групи мишки, жертвани в посочените часови точки (стълбовете показват медиани) (n = 5 [заразени групи на ден 14 или ден 21] или n = 10 [всички останали групи]). Не са наблюдавани гъбични тежести за незаразената група. CSP, 1 mg/kg каспофунгин; ГРИП, 5 mg/kg флуконазол; Имуно, имунокомпрометирано.

Диетичният модел може да се използва за оценка на преживяемостта в отговор на дисеминирана кандидоза, придобита чрез стомашно-чревния тракт.

Разпространението на C. albicans от стомашно-чревния тракт намалява оцеляването на имунокомпрометиран гостоприемник. Мишките бяха заразени с 4.2 × 107 клетки от див тип щам C. albicans, както е описано в легендата на фиг. 1В. Четири последователни дози циклофосфамид (150 mg/kg) и преднизолон (65 mg/kg) са приложени както на заразени, така и на неинфектирани контролни групи в посочените часови точки (стрелки надолу) и оцеляването се наблюдава в продължение на 30 дни (n = 9 [ заразена група] или n = 10 [незаразена група]). Въз основа на анализ на логаритмичен ранг, наблюдавахме статистически значима разлика между заразените и неинфектираните групи (P = 0,0002).

Противогъбичните средства инхибират специфично разпространението на C. albicans от стомашно-чревния тракт.

ДИСКУСИЯ

Основно предимство на модела на миши GI за дисеминирана кандидоза, който разработихме в това проучване, е, че първоначалната колонизация се постига чрез използване на пречистена диета, а не на антибиотици. Диетичният подход води до намаляване на органичните киселини в стомашно-чревния тракт (в сравнение с нивата, наблюдавани при използване на търговски диети), което насърчава растежа на C. albicans и намалява растежа на конкурентната бактериална флора (32). Тъй като C. albicans обикновено се среща като коменсал на стомашно-чревния тракт на бозайниците при здрави индивиди, диетичният подход най-вероятно осигурява по-добро сближаване на естествената чревна среда на хората. Нашата констатация, че имуносупресията като цяло има по-голям ефект върху системните гъбични тежести в сравнение с органите на стомашно-чревния тракт, също така категорично предполага, че нарастването на системното гъбично натоварване на органи, което наблюдаваме при имуносупресия, се дължи до голяма степен на увеличената транслокация на C. albicans през стомашно-чревния тракт ( т.е. не индиректна последица от повишена гъбична тежест в стомашно-чревния тракт). Едно ограничение на нашето проучване обаче е, че е използван само един изолат на C. albicans. В бъдещи изследвания ще бъде интересно да се тества точността на нашия модел, като се използват множество изолати.

Допълнителен материал

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на Arlene Farias за нейната помощ с животинските модели, както и на Mohua Banerjee за техническата подкрепа. Също така благодарим на членовете на Центъра за медицинска микология в Сан Антонио, както и на Скот Филър, Ашраф Ибрахим и Рори Дънкан за полезните им съвети и предложения.

Съдържанието е отговорност единствено на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на Националния институт по алергия и инфекциозни болести или на Националните здравни институти.