Разследване на ролите, методология, валидиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

затлъстяване

Институт за хуманна генетика, Университет Юлий Максимилианс, Вюрцбург, Германия

Роли Формален анализ

Институт за хуманна генетика, Университет Юлий Максимилианс, Вюрцбург, Германия

Център за плодовитост на партньорството; Висбаден, Германия

Център за плодовитост на партньорството; Висбаден, Германия

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Институт за хуманна генетика, Университет Юлий Максимилианс, Вюрцбург, Германия

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Институт за хуманна генетика, Университет Юлий Максимилианс, Вюрцбург, Германия, Колеж по здравеопазване и науки за живота, Университет Хамад бин Халифа, Образователен град, Доха, Катар

  • Рамя Потабатула,
  • Маркус Дитрих,
  • Мартин Шорш,
  • Томас Хан,
  • Томас Хааф,
  • Нади Ел Хадж

Фигури

Резюме

Цитат: Potabattula R, Dittrich M, Schorsch M, Hahn T, Haaf T, El Hajj N (2019) Ефекти на мъжкото затлъстяване върху метилирането на ДНК на сперматозоиди и кръв от пъпна връв от следващо поколение. PLoS ONE 14 (6): e0218615. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0218615

Редактор: Ивон Ботчер, Университет в Осло, НОРВЕГИЯ

Получено: 7 януари 2019 г .; Прието: 5 юни 2019 г .; Публикувано: 27 юни 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: R.P. беше подкрепен от стипендия на Германската инициатива за върхови постижения във Висшето училище по науки за живота, Университет във Вюрцбург. Това проучване беше подкрепено от Германската изследователска фондация (предоставяне на EL 742/1-1 на N.E.H.) и Европейския съюз (ERAofART на T.Hf.). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Съкращения: ART, Асистирана репродуктивна технология; ИТМ, индекс на телесна маса; DLK1, делта-подобен 1 хомолог; dNTPs, дезоксирибоза нуклеозидни трифосфати; EDTA, етилендиамин тетраоцетна киселина; EWAS, проучване на епигеном с широка асоциация; FCB, фетална пъпна кръв; FDR, процент на фалшиви открития; НС1, хлороводород; HIF3A, хипоксия индуцируем фактор 3 алфа; HNA, хиперметилиране на неотпечатания алел; ICSI, интрацитоплазмена инжекция на сперматозоиди; IG DMR, интергенна диференциално метилирана област; IGF2, инсулиноподобен растежен фактор 2; IUGR, вътрематочно ограничаване на растежа; IVF, ин витро оплождане; MEG, гени, експресирани от майката; MEST, конкретна транскрипция за мезодерма; MgCl2, магнезиев хлорид; NaCl, натриев хлорид; NNAT, невронатин; PCR, полимеразна верижна реакция; PEG, бащино експресирани гени; POMC, про-опиомеланокортинов ген; SDS, натриев додецил сулфат; SGCE, епсилон саркогликан; SNRPN, малък ядрен рибонуклеопротеинов полипептид N; КОЙ, световна здравна организация

Въведение

Според Световната здравна организация (СЗО), разпространението на затлъстяването в световен мащаб се е удвоило почти двойно от 1980 г. Затлъстяването се разглежда като сложно многостранно заболяване с широк спектър от детерминанти, включително поведенчески и наследствени причини [1]. Изчислената наследственост на затлъстяването е приблизително 75%, въпреки това идентифицираните генетични варианти досега могат да обяснят по-малко от 30% от нивата на индивидуалния индекс на телесна маса (ИТМ) и вариациите в теглото [2]. Наскоро няколко изследователски усилия се фокусираха върху определянето дали има епигенетична основа, влияеща на риска от метаболитни нарушения [3]. Голямо многоцентрово проучване за асоцииране с широк епигеном (EWAS) идентифицира повишено метилиране на гена, индуцируем от хипоксия фактор 3 алфа (HIF3A) в кръвта и мастната тъкан, който се свързва с повишен ИТМ [4]. Освен това се съобщава, че варираща метилирана област в гена на про-опиомеланокортин (POMC) регулира човешкото телесно тегло [5].

Известно е, че отпечатаните гени избягват вълната от препрограмиране на метилиране по време на ранната ембриогенеза и са предложени като носители на епигенетична информация в следващото поколение [20]. В резултат на това всякакви епигенетични промени в импринтираните гени могат да бъдат предадени чрез зародишните клетки, като по този начин допринасят за бъдещ риск от заболяване. Отпечатаните локуси показват експресия, зависима от родител на произход, регулирана от епигенетично заглушаване или на майката, или на бащата. Белезите на метилиране се наслеждат стабилно чрез зародишната линия, което води до моно-алелна експресия във всички соматични тъкани [21]. Отпечатаните гени са добре известни за контролиране на растежа на плода, където родителската „теория на конфликта“ предлага гените, експресирани от баща (PEG), да насърчават усвояването на храна от майката, докато гените, експресирани от майката (MEG), ограничават използването на ресурси от потомството [22]. Известно е също, че отпечатаните гени играят важна роля в широк спектър от биологични процеси и заболявания, включително вътрематочно ограничаване на растежа (IUGR), затлъстяване и захарен диабет [23].

За да изследваме свързаните с мъжкото затлъстяване промени в сперматозоидите и тяхното епигенетично предаване в следващото поколение, направихме задълбочен анализ на метилирането в регулаторните региони на четири майки с импринт, генерирани от баща, три локуса, отпечатани от бащата, както и индуцируем от хипоксия фактор 3 алфа субединица (HIF3A) в голяма кохорта от 294 проби от човешки сперматозоиди, подложени на ин витро оплождане (IVF) или интрацитоплазмена инжекция на сперматозоиди (ICSI), както и в събраната фетална пъпна кръв (FCB) на съответното им потомство, когато е постигнато живо раждане.

Материали и методи

Етично одобрение и съгласие за участие

Комитетът по етика към медицинския факултет на университета във Вюрцбург одобри това проучване върху проби от човешка сперма и фетална пъпна връв (№ 117/11 и 212/15). Писмено информирано съгласие беше събрано от всички участващи двойки.

Проби за изследване

Оставените плуващи сперматозоиди (излишък от материал) след IVF/ICSI бяха събрани в Центъра за плодовитост във Висбаден, псевдонимизирани и замразени при -80 ° C до по-нататъшна употреба. В това проучване кохортата на човешките сперматозоиди се състои от общо 294 проби, включително сперма от 103 мъже, при които е постигнато живо раждане след асистирана репродуктивна технология (ART). Успяхме да вземем проби от фетална кръв от пъпна връв от сътрудничещи си акушерски клиники в цяла Германия. След живо раждане, общо 113 FCB проби (включително 10 двойки близнаци) са събрани от новородени след успешно IVF/ICSI.

Изолация на геномна ДНК и конверсия на натриев бисулфит

Бисулфитно пиросеквениране

За дизайн на грунд (таблица S1) е използван софтуерът Pyro-Mark Assay Design 2.0 (Qiagen, Hilden, Германия). Нива на метилиране на четири бащино експресирани гена PEG1/специфичен за мезодерма транскрипт (MEST), PEG4/малък ядрен рибонуклеопротеинов полипептид N (SNRPN), PEG5/невронатин (NNAT) и PEG10/епсилон саркогликан (SGCE), три бащино отпечатани диференцирани локуса H19 метилиран регион (IG DMR), инсулиноподобен растежен фактор 2 (IGF2) диференциално метилиран регион 0 (DMR0) и MEG3-IG DMR и един неотпечатан ген HIF3A са количествено определени. Тестовете бяха установени чрез използване на стандарти за метилиране с 0%, 25%, 50%, 75% и 100% метилиране. Полимеразна верижна реакция (PCR) за всяка проба беше проведена в реакция от 25 μl, състояща се от 2.5 μl 10x PCR буфер с MgCl2, 0.5 μl (10mM) dNTPs, 1.25 μl (10 pmol/ml) от всеки обратен и напред праймер, 0.2 μl (5 U/μl) FastStart Taq ДНК полимераза (Roche Diagnostics, Манхайм, Германия), 1 μl (

25 ng) бисулфитно преобразувана ДНК и 18.3 μl dH2O. Пиро-секвенирането се извършва с помощта на софтуера Pyro Q-CpG (Qiagen, Hilden, Германия) и комплекта реактиви на PyroMark Gold Q96 CDT на системата PyroMark Q96 MD. Неметилирани и напълно метилирани ДНК стандарти (Qiagen, Hilden, Германия) бяха използвани като контроли във всеки пиросеквениращ цикъл.

Статистически анализ

За FCB данни със стойности на метилиране на отпечатани гени в средния диапазон бяха използвани многовариационен регресионен анализ, използващ класически линейни модели. Извършена е многократна корекция на теста за степен на фалшиво откриване (FDR), използвайки метода на Бенджамини и Хохберг. Моделите на регресия включват тегло при раждане и гестационна седмица на детето, възраст на бащата и майката, ИТМ на бащата и майката и пол на детето, включително взаимодействието между ИТМ на бащата и майката и пола на детето, за да се даде възможност за различен ефект от бащата и ИТМ на майката между половете на FCB.

Резултати

Характеристики на пробите в изследването

Индексът на телесна маса (ИТМ) се изчислява от измереното тегло (в килограми) и височина (в сантиметри) на участващите индивиди. Въз основа на насоките на СЗО за категоризация на ИТМ за възрастни, от 294 проби сперма, една проба (0,34%) с 17,30 ИТМ е попаднала в клас „под тегло“; 144 проби (48,97%) в клас на „нормално тегло“ (ИТМ: 19,00–24,90); 149 проби (50,68%) в клас „Пред-затлъстяване/затлъстяване“ (ИТМ: 25.00–40.30). За да бъдем по-конкретни, 120 проби са „предварително затлъстели“ (BMI: 25.00–29.90), а останалите 29 проби са класифицирани като затлъстели (BMI: 30.00–40.30). Кохортата от проучването на FCB се състои от общо 113 събрани проби от FCB (включително 10 двойки близнаци) от потомство, породено от 103 от 294 донора на сперма след успешно IVF/ICSI. Сред тях 54 проби (47,79%) са жени и 59 проби (52,21%) са мъже. Теглото при раждане значително корелира с гестационната седмица на детето (rho = 0,67, p Таблица 1. Клинични параметри на проби от сперма и фетална пъпна връв.

Съответните демографски данни, които бяха разгледани в регресионните модели за анализираните проби от сперма и фетална пъпна връв.

Подписи за метилиране на ДНК на сперматозоиди, корелиращи с ИТМ на донора

Корелацията на индекса на телесна маса на донора (kg/m 2) с ДНК метилиране (%) на осем анализирани ампликони в спермата. Моделът е адаптиран за концентрацията на сперматозоиди, възрастта на донора и успеха на ART.

Предаване на ефекти на ИТМ по бащина линия от сперматозоиди към следващо поколение по специфичен за пола начин

Скатерни графики, показващи корелацията между MEG3-IG DMR, HIF3A, IGF2 и NNAT метилиране и ИТМ на бащата при проби от мъжка фетална пъпна връв (горен панел) и женска фетална пъпна кръв (долен панел). Всяка точка в графиката представлява средното метилиране на няколко насочени CpGs в отделна проба от пъпна връв след измерване чрез бисулфитно пиросеквениране. Регресионната линия предполага посока на корелация с ИТМ на бащата. RE за всяка графика показва оценката на регресията.

Корелацията на индекса на телесна маса на баща (kg/m 2) с ДНК метилиране (%) на осем анализирани ампликони в проби от фетална пъпна кръв от следващо поколение. Моделът включва теглото при раждане и гестационната седмица на детето, възрастта на бащата и майката, ИТМ на майката и пола на детето, включително взаимодействието между ИТМ на бащата и пола на детето, за да позволи различен ефект на ИТМ по бащина линия между половете на FCB.

Корелацията на индекса на телесна маса на майката (kg/m 2) с ДНК метилиране (%) на осем анализирани ампликони в проби от фетална пъпна кръв от следващо поколение. Моделът включва тегло при раждане и гестационна седмица на детето, възраст на бащата и майката, ИТМ на бащата и пол на детето, включително взаимодействието между ИТМ на майката и пола на детето, за да позволи различен ефект на ИТМ на майката между половете на FCB. Нито един от анализираните ампликони не показва връзка между метилирането на пъпната кръв и ИТМ на майката.

Дискусия

Освен това установихме, че нивата на метилиране на ДНК на свързания със затлъстяването ген HIF3A показват положителна корелация с ИТМ на бащата в кръвта от пъпна връв на мъжки деца (р-стойност = 0,041). Преди това голямо проучване за асоцииране на метилиране на ДНК в пълноценна кръв и мастна тъкан на възрастни (за разлика от сперматозоидите и пъпната кръв в настоящото проучване) идентифицира значителна корелация между ИТМ и метилиране на три места на CpG в първия интрон на HIF3A [4 ]. Няколко проучвания възпроизвеждат гореспоменатата асоциация в локуса на HIF3A в различни тъкани, включително ДНК на пъпната връв на новородени [30–33]. Докато едно проучване съобщава, че връзката между метилирането на ДНК на кръвта на гена HIF3A и ИТМ на донора е по-силна при подгрупата на младата възраст (≤ 66 години) [34], друг доклад не открива никаква връзка между двете [35]. Резултатът от настоящото ни проучване противоречи на асоциациите, наблюдавани между родителския ИТМ и метилирането на потомството HIF3A в проучване на Richmond et al, 2016 [36]. Тук авторите измерват метилирането, като използват масива Infinium HM450 BeadChip

1000 проби и изследвани асоциации на индивидуално ниво на CpG, но те не са приложили никакви специфични за пола тестове при потомството [36]. Освен това измерихме метилирането в ДНК на пъпна кръв на деца, родени след IVF/ICSI, което може да бъде допълнителен объркващ фактор в нашето проучване. Важно е да се подчертае, че предишните доклади, в допълнение към настоящото проучване, са тествани само за връзки между HIF3A метилиране и нива на ИТМ, които не показват причинно-следствената връзка на промените на HIF3A метилиране към затлъстяването. Подобно на предишните проучвания в човешка кръв [34–36] и в сперматозоиди [19], представените данни подкрепят идеята, че метилирането на ДНК (на HIF3A и други гени) е по-скоро ефект, отколкото причина за повишен ИТМ.

Заключения

В това проучване ние се фокусирахме върху епигенетичните промени в сперматозоидите във връзка с ИТМ на донора и дали тези промени могат да бъдат предадени на потомството. Идентифицирахме фини промени в метилирането, корелиращи с ИТМ на донора при мъжки сперматозоиди в отпечатания от бащата MEG3-IG DMR локус. Наблюдава се специфична за пола корелация между ДНК метилирането на MEG3-IG DMR, HIF3A и IGF2 DMR0 в пъпната кръв на потомството и ИТМ на бащата. Нашите резултати показват, че затлъстяването при мъжете може да повлияе на програмирането на ДНК метилиране в спермата и също така да повлияе на епигенома от следващото поколение. Тези открития са в съответствие с по-ранните изследвания при хора [17, 19, 37, 39]. Епигенетичното наследство може да помогне да се обясни ескалиращата честота на затлъстяване в световен мащаб, което не може да се отдаде на генетични фактори сами по себе си. Независимо от това, остава да се покаже дали тези промени могат да повлияят на риска от развитие на затлъстяване у потомството по време на зряла възраст. Необходимо е надлъжно проследяване на нашата изследвана кохорта, за да помогне да се отговори на този въпрос.

Подкрепяща информация

S1 Таблица. PCR и праймери за секвениране, използвани за бисулфитно пиросеквениране.

Таблица S1 показва предния и обратния праймери за полимеразна верижна реакция и бисулфитно пиросеквениране за всичките осем ампликона, анализирани в това проучване. Праймерите, обозначени със звезда, са биотинилирани в 5 ’края и хромозомното местоположение се основава на освобождаването на Ensembl 89.

Файл S1. Корелации на ДНК метилиране без приспособяване към объркващи фактори.

Файл S1 показва статистиката за метилиране, когато метилирането на ДНК е свързано с ИТМ, без да се приспособява към някакви объркващи фактори.

Файл S2. Корелация на ДНК метилиране между спермата и пъпната кръв.

Файлът S2 показва ранга на ранг на копие на нивата на метилиране на ДНК в сперматозоидите и съответните проби от пъпна кръв.

Благодарности

Благодарим на всички двойки и акушерски клиники, участващи в проучването.

Препратки

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "ДНК метилиране" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Сперма" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Индекс на телесна маса" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Кръв" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Затлъстяване" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Епигенетика" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Детско затлъстяване" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Регресионен анализ" приложим за тази статия? да не