Zhi-Jun Zang

1 Катедра по безплодие и сексуална медицина, Третата свързана болница, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу, Китай

Хонг-Фън Танг

2 Катедра по дерматология, Първа болница на Шунде, свързана с Южния медицински университет, Фошан, Китай

Ин Туо

3 Катедра по хистопатология, Първата свързана болница, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу, Китай

Wei-Jie Xing

4 Център за репродуктивна медицина, Третата свързана болница, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу, Китай

Су-Юн Джи

5 Департамент по дерматология, провинциална дерматологична болница Гуангдонг, Гуанджоу, Китай

Йонг Гао

6 Център за репродуктивна медицина и ключова лаборатория по репродуктивна медицина в провинция Гуангдонг, Първата свързана болница, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу, Китай

Чун-Хуа Денг

7 Катедра по урология, Първата свързана болница, Университет Сун Ятсен, Гуанджоу, Китай

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Броят на лицата на възраст над 65 години се е увеличил повече от 10 пъти през изминалия век и според настоящите демографски тенденции той ще продължи да се увеличава.1 Бързият растеж на застаряващото мъжко население е съпътстващ с повишено разпространение на възрастта -свързани заболявания като сърдечни заболявания, хипертония, рак, остеопороза, доброкачествена простатна хиперплазия и диабет. Късният хипогонадизъм (LOH) също е едно от най-често срещаните заболявания, свързани с възрастта. Според препоръките на Lunenfeld et al., LOH се определя като клиничен и биохимичен синдром, свързан с напредването на възрастта и характеризиращ се с хипогонадни симптоми (лоша сутрешна ерекция, ниско сексуално желание и еректилна дисфункция) и спад в серумните нива на тестостерон (общо тестостерон под 11 nmol l -1 и свободен тестостерон под 220 pmol l -1) .2,3 Има много други симптоми, свързани с LOH, включително увеличаване на мастната маса, загуба на мускулна маса, умора, безсъние, намаляване на костната минерална плътност и остеопороза, лошо концентрация, забрава и депресия.4,5 Тежкият LOH дори се счита за свързан със значително по-високи рискове от всички причини и сърдечно-съдова смъртност.6 И така, LOH влияе значително на качеството на живот и здравето на застаряващите мъже.

През последните години тестостероновото заместително лечение (TRT) се прилага широко при мъже с LOH и се съобщава като ефективна терапия за облекчаване на основните симптоми и подобряване на качеството на живот.7,8,9 Въпреки това, някои странични ефекти на екзогенен тестостерон не може да се игнорира, като прекомерно либидо и агресия, еритропоеза, чернодробни тумори, интрахепатална холестаза, хепатотоксичност, чернодробна недостатъчност и сънна апнея.1 TRT не се препоръчва при мъже с рак на гърдата, рак на простатата и симптоми на долните пикочни пътища, причинени от уголемена простата.10 Мъжете, които желаят да поддържат плодовитостта, също се съветват да не използват TRT, тъй като екзогенният тестостерон може да потисне оста хипоталамус-хипофиза-гонада (ос HPG) и да доведе до безплодие. TRT, като същевременно се избягват неблагоприятни ефекти, ще бъде много по-добра алтернатива.

Като типично животинско лекарство, кадифеният рог (VA) се използва в традиционните китайски лекарства повече от 2000 години. Няколко страни като Китай, Япония и Корея са определили VA от елени и благородни елени, както е подходящо за медицинска употреба.12 VA обикновено се използва за подобряване на сексуалното функциониране или забавяне на процеса на стареене в тези страни и са установени положителните му ефекти .13,14,15,16 Въпреки това, има малко доклади, обсъждащи основните механизми на VA. Няколко изследвания предполагат, че кадифеният рогов полипептид (VAP) е основният активен компонент във VA.17,18,19 Целта на това проучване е да се оцени дали VAP може да повиши нивото на тестостерон in vivo и да подобри сексуалната функция на старите мъже мишки. Освен това тествахме експресията на няколко ограничаващи скоростта ензими на синтеза на тестостерон, включително стероидогенен остър регулаторен протеин (StAR), цитохром P450 холестерол ензим за разцепване на страничната верига (P450scc) и 3β-хидроксистероид дехидрогеназа (3β-HSD) усилията за изясняване на механизма на действие на VAP в този процес.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Декларация за етика

Протоколите за животни и експерименти бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета Sun Yat-sen. Всички животни са получили хуманни грижи и са положени всички усилия за свеждане до минимум на страданието. След експериментите извършихме евтаназия на животните чрез вдишване на CO2.

Животни

Всички мъжки мишки C57BL/6 са закупени от Центъра за животни на Университета Сун Ятсен (Гуанджоу, Китай) и се поддържат по график от 12 часа на ден/12 часа през нощта (светлините светват от 19:00 до 07:00 h) при постоянна температура (22 ± 1 ° C) и влажност (60%). Тези мишки са били на възраст приблизително 24 месеца и са били настанени единствено в клетки. Женските мишки бяха на възраст около 3 месеца и бяха настанени по пет на клетка.

Серумите на всяка мъжка мишка бяха събрани от ретробулбарното пространство, за да се позволи количествено определяне на серумния тестостерон. Само тези със серумна концентрация на тестостерон под 8 ng ml -1 бяха приети и произволно разпределени в четири различни групи. Всяка група съдържа 10 мъжки мишки.

Женските мишки бяха използвани като стимулиращи жени при поведенчески тестове и бяха резецирани с двойни яйчници. Един месец след овариектомия, всяка женска мишка е била предварително обработена с естрадиол бензоат (50 μg, 48 часа преди тестването, разтворен в 50 μl фъстъчено масло) и прогестерон (500 μg, 5 h преди тестване, разтворен в 50 μl фъстъчено масло) естрозно състояние.

Наркотици

VA от Cervus nippon Temminch е добита в базата за разплод на елени, свързана с Bei Jing Jiu Lu Deer Industry Breeding Co., Ltd., Пекин, Китай. VAP е изолиран от тези VA от Училището по химия и химическо инженерство, Южнокитайски технологичен университет. VAP е светъл, жълт прах с молекулно тегло 3.2 kDa. Основната съставка на VAP е описана по-рано.12 След разтваряне в дестилирана вода, VAP се прилага перорално в продължение на пет последователни седмици. Едната група беше третирана с нишесте като контролна група, а останалите три групи бяха третирани с VAP в различни дози всеки ден (100, 200 и 300 mg kg -1 ден -1).

Тестове за сексуално поведение

Тестовете за сексуално поведение са описани по-рано.20 Следните цели на мярката са записани и отбелязани: латентността на монтиране, интромисия и еякулация; честотата на монтиране и намеса; копулаторна ефикасност (изчислена като честота на пропускане, разделена на честота на монтиране + честота на пропускане) Тестовете бяха проведени в чиста клетка за тестване (40 cm × 26 cm × 21 cm) в тиха среда. Мъжките мишки бяха поставени индивидуално в тестващата клетка за предварителна адаптация. След 15 минути предварително обработена женска мишка беше поставена в същата клетка за тестване. Ако минаха 10 минути без намеса, тази женска мишка беше заменена с друга предварително обработена женска мишка. Ако мъжката мишка не успее да постигне повторно предаване с втората женска мишка в рамките на следващите 5 минути, трета предварително обработена женска мишка се въвежда за последните 15 минути. Неуспехът да се постигне проникване в рамките на 15 минути и еякулация в рамките на 45 минути от началото на теста доведе до прекратяване на теста и за това поведение беше определена максималната стойност на латентност от 45 минути. Всички тестове за сексуално поведение се извършват от наблюдател, който не знае към коя група принадлежат тези мъжки мишки.

Претегляне на тялото и репродуктивните органи

Двадесет и четири часа след получаване на последното хранене, всяка от мъжките мишки беше първо претеглена. След това всички животни се анестезират с етер и се вземат кръвни проби от кухата вена. Серумът се отделя за измерване на тестостерона. Веднага след събирането на кръвни проби бяха получени и претеглени двустранни тестиси, епидидимиди и семенни везикули.

Тестове за тестостерон

Тестостеронът в серума се определя чрез ензимно-свързан имуносорбентен тест (ELISA) (R & D Systems, Минеаполис, MN, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Концентрациите на интрастестикуларен тестостерон (ITT) бяха анализирани, както е описано по-горе.21 Накратко, тестикуларните тъкани (50 mg), получени от всяка мишка, се хомогенизират чрез ултразвук (2 s × 20 s) в разтвор на фосфатен буфер (PBS) и след това се центрофугират при 10 000 g за 10 минути. Концентрациите на тестостерон в супернатантите също се определят, като се използва комплект ELISA (R and D Systems, Минеаполис, MN, САЩ), съгласно инструкциите на производителя. Резултатите са изразени като ng g -1 тъкан.

Имунофлуоресцентно оцветяване

маса 1

Първични и вторични антитела, използвани за имунофлуоресцентен анализ

рога

Количествена PCR в реално време

Общата РНК от тестисите беше извлечена с помощта на мини комплект RNeasy (Qiagen, Токио, Япония) съгласно протокола на производителя. Реакциите на обратната транскрипция бяха извършени с използване на обратна транскриптаза на миши левкемичен вирус и олиго-dT праймери (Fermentas, Литва). PCR в реално време се извършва с помощта на Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japan) следвайки инструкциите на производителя. За откриване на сигнали е използвана система за откриване на Light Cycler 480 (Roche, Базел, Швейцария). β-актин иРНК е избран като вътрешен контрол. Последователностите на грунда са изброени, както следва: 5-GGGCATACTCTCAACAACCAG-3 (горен грунд) и 5-ACCTCCAGTCGGAACACC-3 (долен грунд) за StAR, 5-AGTATCCGTGATGTGGGG-3 (горен грунд) и 5-CATACAGTGTCGCCTTTTCT-3 (долен грунд) P450scc, 5-TGTGCCAGCCTTCATCTAC-3 (горен грунд) и 5-CTTCTCGGCCATCCTTTT-3 (долен грунд) за 3β-HSD и 5-TCGTGCGTGACATTAACGAG-3 (горен грунд) и 5-ATTGCCTATCGTGATGACCT-3.

Статистически анализ

За оценка на значимостта на разликите е използван еднопосочен ANOVA за множество групови сравнения. Резултатите бяха представени като средно ± s.e.m. Във всички случаи, P Фигура 1 . Латентността на монтирането е съкратена при дозата от 200 mg kg -1 (P -1 (P -1 (P 0,05). Сравнението на честотата на монтиране показва, че въпреки че и трите експериментални групи са имали възходяща тенденция, само промяната при 200 mg kg -1 е статистически по-висок от контролния (P -1 група и 300 mg kg -1 група в сравнение с контролната група (P -1 (P -1 (P -1 (P> 0.05).

Предполага се, че сърдечно-съдовият риск е свързан с TRT.52 За сърдечно-съдовата безопасност Американската администрация по храните и лекарствата (FDA) е въвела строги разпоредби в производството и продажбите на тестостеронови продукти и е отсъдила много от тях.53,54 споменатото по-горе VA се счита за полезно за лечение на сърдечна недостатъчност.36 Според нашите данни всички животни показват перфектно здравословно състояние и по време на експеримента не са наблюдавани странични ефекти, което означава, че VAP е безопасен. Взети заедно, ние смятаме, че VAP може да подобри ендогенния тестостерон и да е от полза за сърдечните заболявания. Следователно, VAP може да бъде добър избор за пациенти с LOH със сърдечно-съдови заболявания.

Според нашите резултати не се наблюдават очевидни дозозависими ефекти и ефектът при дозата от 200 mg kg -1 изглежда най-забележим. Това явление показва, че VAP може да има оптимална доза за лечение. Има някои ограничения за нашето проучване. Предишни изследвания показват, че синтезът на тестостерон се модулира от оста HPG. Необходими са допълнителни проучвания, за да се изследва дали приложението на VAP има ефект върху освобождаването на гонадотропин-освобождаващ хормон, лутеинизиращ хормон и фоликулостимулиращ хормон. В допълнение, броят на пробите в настоящото проучване е сравнително малък, което може да повлияе на силата на статистическите тестове.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нашите резултати показват, че VAP има физиологична роля в синтеза на тестостерон чрез засилване на експресията на StAR, P450scc и 3β-HSD в тестисите на застаряващи мъжки мишки. Прилагането на VAP може да е безопасен терапевтичен метод за лечение на LOH и все още трябва да се извършат допълнителни клинични проучвания и оценки на безопасността при хора.

ВНОСКИ НА АВТОРА

ZJZ проектира и извърши експериментите, анализира данните, изготви ръкописа и ръководи екипа. HFT помогна за проектирането на проучването, провеждането на експериментите и изготвянето на ръкописа. YT и WJX помогнаха за провеждането на експериментите. SYJ и YG помогнаха при анализа на данните. CHD замисли идеята на това изследване. Всички автори прочетоха и одобриха окончателната версия на ръкописа.

КОНКУРЕНТНИ ИНТЕРЕСИ

Авторите заявяват, че нямат конкуриращи се интереси.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа е подкрепена от Националната фондация за естествени науки на Китай (No. 81302223) и Фондацията за медицински изследвания в провинция Гуангдонг, Китай (B2013104).