Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Университет Уилкс, Уилкс-Баре, Пенсилвания, 18766

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Penn State Hershey College of Medicine, Hershey, Пенсилвания, 17033

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Кореспонденция

Дарина Л. Лазарова, Медицински колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания 18509. Тел: 570‐504‐9645; Факс: 570‐504‐9636; Имейл: [email protected]

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Университет Уилкс, Уилкс-Баре, Пенсилвания, 18766

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Penn State Hershey College of Medicine, Hershey, Пенсилвания, 17033

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Медицинският колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания, 18509

Кореспонденция

Дарина Л. Лазарова, Медицински колеж на Британската общност, Скрантън, Пенсилвания 18509. Тел: 570‐504‐9645; Факс: 570‐504‐9636; Имейл: [email protected]

Резюме

Въведение

Въпреки че общата честота на колоректалния рак намалява през последните 35 години, честотата на заболяването се е увеличила сред 20-34-годишните и до 2030 г. може да има до 90% увеличение на рака на дебелото черво (CC ) честота в тази възрастова група 1. Тази промяна във възрастовата честота се дължи отчасти на нарастващото затлъстяване сред децата и юношите 2. Въпреки че се обсъждат механизмите, чрез които затлъстяването предразполага към чревна неоплазия, една от възможностите е свързаните със затлъстяването цитокини (адипокини) да си сътрудничат с иницииращи рака мутации в подкрепа на неопластичното развитие в дебелото черво. Мастната тъкан и макрофагите, инфилтриращи тази тъкан, секретират високи нива на цитокини, включително TNFalpha, интерлевкини и WNT5A, които активират AKT, ERK, JNK и JAK/STAT сигнализация 3. Наскоро анализите на данните от Атласа на генома на рака (TCGA) разкриха, че пациентите със затлъстяване с CC (с индекс на телесна маса 30 или по-голям) имат по-малък брой мутации на шофьорски ген, отколкото пациенти с CC с нормално тегло Едно от възможните обяснения на това наблюдение е, че нивата на насърчаване на неоплазмата на пътищата за оцеляване при затлъстели индивиди се поддържат от адипокини, а не от генни мутации на водача.

Целта на нашето проучване беше да се установи дали допълнителната неопластична тежест при мишки, свързана с индуцирано затлъстяване, се потиска от добавка от прополис. Използвахме Прополис с Cyclopower (Manuka Health Нова Зеландия), която преди това сме характеризирали инвитро 14, 16. Тази добавка от прополис е формулирана с олигозахарид гама-циклодекстрин; поради това олигозахаридът беше включен като контролна добавка в интервенционните диети.

Материали и методи

Животни

Анализи на тъкани

Червата (тънките черва и дебелото черво) се дисектират, фиксират се в Histochoice MB (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) за 24 часа и се прехвърлят в 70% етанол. Представителните тъкани с или без лезии бяха замразени в течен азот. Чревни неоплазми са преброени от трима изследователи и средният брой е изчислен въз основа на тези независими преброявания. За да се изчисли размерът на лезиите, са направени снимки на лезиите с камера AmScope MA ‐ 1000 върху дисекционен микроскоп Nikon SMZ645, изображенията са получени с помощта на софтуера Nikon ACT ‐ 1, а размерът (повърхността) на лезиите е установен с Image J. Минимум 70% от всички лезии на червата са били обработени, за да се получи среден размер. За хистологични изследвания използвахме техниката „швейцарско руло“, за да анализираме цялата дължина на червата 24. Хистопатологичните оценки се основават на оцветени с хематоксилин и еозин слайдове от двама заслепени за интервенционните патолози и според номенклатурата за чревна неоплазия при мишки 20. Ниско- и високостепенна дисплазия се определя, както се препоръчва от номенклатурата за чревна неоплазия при модели на мишки 20 .

Клетъчна култура и химикали

Клетъчната линия на човешкия колоректален рак HCT ‑ 116, нормалната човешка фетална клетъчна линия CCD841CoN и мишата фибробластна клетъчна линия 3T3-L1 са от Американската колекция на тъканната култура. Клетките се отглеждат в алфа-MEM среда с 10% фетален говежди серум. Подобрен прополис с фенетил естер на кофеинова киселина (CAPE) (Прополис с CycloPower) беше подарък от Manuka Health New Zealand Ltd. за инвитро проучвания, прополисът се разтваря в диметилсулфоксид при 100 mg/ml; основният разтвор се поддържа при -80 ° С.

Western blot анализи

Екзоме секвениране и анализ

Секвенирането на екзома на мишка беше извършено върху геномна ДНК от вградени в парафин тънки черва. Извличане на ДНК, подготовка на библиотека, улавяне на мишка Agilent SureSelect (51 Mb); HiSeq2500 PE100‐125 и анализ на екзома на платформата DNAnexus (In/Del, SNV и CNV анализ) бяха извършени от Otogenetics (Norcross, GA). Всички данни бяха анализирани със софтуер за картографиране BWA (за картографиране на ниско дивергентни последователности спрямо голям референтен геном) и инструментариум за анализ на генома (SNP/Indel pipeline, софтуер за анализ на високопроизводителни данни за секвениране, разработен в Broad Institute). Еднонуклеотиден полиморфизъм (SNP) бе анотиран срещу референтен геном GRCm38/mm10. Базата данни за соматични мутации беше търсена за мутации в гени, свързани с рак (изброени в COSMIC, каталог на соматични мутации при рак (http://cancer.sanger.ac.uk/census/).

Статистика

Данните бяха представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Анализът на t-тест на несдвоен студент се използва за определяне на значимостта на статистическите разлики в броя на мутациите между мишки на контролна диета и мишки на диета от западен тип. Разликите бяха счетени за значителни при P

Резултати

Телесно тегло и консумация на храна

Средното наддаване на телесно тегло при мишки, изложени на контролна диета, контролна диета с гама-циклодекстрин и контролна диета с добавка прополис, е сравним (съответно 5,8 ± 1,9, 5,9 ± 1,7 и 6,1 ± 0,9 грама, еднопосочно между групи ANOVA: P = 0.960). Средното наддаване на телесно тегло при мишки, изложени на западна диета, западна диета с гама-циклодекстрин и западна диета с добавка прополис, е съответно 9,0 ± 4,3, 9,1 ± 2,0 и 5,2 ± 1,0 грама, еднопосочно между групите ANOVA: P = 0,052 (фиг. 1А). Между всичките шест интервенционни групи еднопосочната ANOVA установява значителни разлики в наддаването на телесно тегло [F(5, 26) = 3.2063, P = 0,022]. Консумацията на храна е сходна между мишките на контролна, контролно-циклодекстринова и контролно-прополисова диета (съответно 10,3, 8,8 и 8,3 kcal/мишка/ден). По същия начин консумацията на храна не се различава значително между мишките на западна диета, западна диета с гама-циклодекстрин или западна диета с прополис (съответно 14,6, 13,0, 14,0 kcal/мишка/ден).

прополиса

Неопластична тежест: брой и размер на чревните новообразувания

Когато се анализират всичките шест интервенции, в допълнение към гореспоменатите разлики между всеки три лечения (в контекста на контрола или западната диета), post hoc тест на Tukey за коригиране за множество сравнения с 95% увереност разкрива разлики (P 2), средни (5–10 mm 2) и големи (> 10 mm 2). Тази категоризация се обосновава от диапазона на лезиите със среден размер във всичките шест интервенционни групи (диапазонът се определя от най-малкия размер от 4,6 ± 0,8 mm 2, открит при мишки, хранени с западна диета с гама-циклодекстрин, и най-големия размер от 8,0 ± 0,7 mm 2 при мишки, хранени със западна диета). Процентът новообразувания със среден размер (5–10 mm 2) не се различава по статистически значим начин между шестте диетични интервенции [F(5, 26) = 0,4325, P = 0,822] (фиг. 2Б). Процентът на малките и големите аденоми обаче показва обратна корелация с размера на лезиите (Фиг. 2А, С). Групите на допълнителна контролна и западна диета показват по-голям брой малки (2, фиг. 2А) новообразувания и по-малък брой големи (> 10 mm 2, фиг. 2С) новообразувания в сравнение със съответните диети без добавки.

Анализите на процента новообразувания с повърхност по-голяма от 10 mm 2 (фиг. 2C) откриват значителна разлика между шестте интервенционни групи [F(5, 26) = 3.0335, P = 0,028]. Последващият тест на Tukey установи, че процентът на голяма (> 10 mm 2) неоплазма е по-висок при мишки, хранени със западна диета без добавки (23,5 ± 9,8%) в сравнение с процента големи новообразувания при мишки, хранени с контролна диета с добавка от прополис ( 8,2 ± 6,5%, P = 0,043) (W срещу CP, фиг. 2C). Също така процентът на голяма (> 10 mm 2) неоплазма е по-висок при мишки, хранени със западна диета без добавки (23,5 ± 9,8%) в сравнение с тези при мишки, хранени със западна диета с гама-циклодекстрин (11,8 ± 8,1%), P = 0,034) (W срещу WD, фиг. 2С). Анализите на процента новообразувания, по-малки от 5 mm 2, също откриват значителна разлика между шестте интервенционни групи [F(5, 26) = 2.6228, P = 0,048] (Фиг. 2А). Post hoc тестът на Tukey разкрива, че процентът малки (2) новообразувания е по-нисък при мишки, хранени със западна диета без добавки (42,3 ± 10,6%) в сравнение с процента малки новообразувания при мишки, хранени в контрола с добавка от прополис (64,8 ± 8,2%, P = 0,030) (W срещу CP, фиг. 2А).

Степен на чревни лезии

Молекулярни изследвания

Сред трите интервенционни групи на западна диета, размерът на новообразуванията е статистически различен при мишките на западна диета, допълнена с гама-циклодекстрин. Установихме дали този ефект се дължи на способността на гама-циклодекстрин да модифицира пътищата за оцеляване в чревните неопластични тъкани. Western blot анализите с нормални и неопластични тъканни лизати не разкриват постоянни промени в нивата на Akt/pAkt, Stat3/pStat3, Erk/pErk и c-Jun/pc-Jun (данните не са показани). След това тествахме дали по-малкият размер и по-малкият брой новообразувания при мишки, хранени със западна диета с гама-циклодекстрин, се дължат на по-висока апоптоза в чревните тъкани. Нивата на проапоптотичния протеин Bax и разцепената Каспаза 3 (отличителен белег на апоптозата) бяха увеличени в тъканите на мишки на западна диета с гама-циклодекстрин (Фиг. 4А).

Още едно наше наблюдение in vivo Анализите показват, че мишките на западна диета с прополис не наддават телесно тегло в същата степен като мишките, хранени с западна диета или западна диета с гама-циклодекстрин (фиг. 1А) За да обясним това наблюдение на молекулярно ниво, анализирахме основните свързани със затлъстяването сигнални пътища в епидидималните бели мастни тъкани на мишки, хранени със западни диети със или без добавки. Western blot анализите разкриват по-ниски нива на pErk1/2 в епидидималните бели мастни тъкани на мишки, хранени с западна диета с прополис (фиг. 4В); обаче няма последователни промени в нивата на Akt/pAkt, Stat3/pStat3 и pc-Jun/c-Jun (данните не са показани). По-рано съобщавахме, че прополисът хиперактивира ERK сигнализирането в CC клетки инвитро 16. За да се справим с това несъответствие, анализирахме отговора на прополиса в две нормални клетъчни линии: миши фибробласт 3T3-L1 и човешки епителни чревни CCD841CoN. Както съобщихме, прополисът увеличи нивата на pERK1/2 в колоректалния карцином HCT ‑ 116 клетки; обаче нивата на pERK1/2 бяха намалени в нормалните клетки (фиг. 4С).

Мутационен профил на неопластичната тежест при мишки на контрола спрямо западна диета

Дискусия

Затлъстяването е нарастващ проблем в здравеопазването, тъй като е рисков фактор за 10 вида рак 5, 27, включително CC; обаче механизмите за тази асоциация все още са неясни 4, 28. Това изследване е първата транслационна стъпка, която следва върху нашата инвитро констатации за това как прополисът модулира CC клетки 14, 16 и е предназначен да определи дали прополисът влияе върху чревното неопластично развитие in vivo, в контекста на нормалното тегло и затлъстяването.

Сред групите мишки на контролни диети, групите, изложени на добавки, гама-циклодекстрин и прополис, намаляват неопластичната прогресия, определена от средния размер и броя на всички лезии, както и от степента на дисплазия. Открито е статистически значимо намаляване на броя на аденомите при мишки, хранени с контролна диета, допълнена с прополис, в сравнение с мишки, хранени с контролна диета без добавки. В сравнение с мишките на контролна диета без добавки, мишките, хранени с контролна диета с гама-циклодекстрин, също показват намаляване на броя на лезиите и степента на дисплазия; тези разлики обаче не са статистически значими.

Сред трите интервенционни групи на западна диета разликите в броя на новообразуванията не са статистически значими; като има предвид, че разликите в размера на неоплазмата са статистически значими. Групата с най-малък брой/размер на аденомите и най-голям процент лезии с ниска степен на дисплазия е групата на западна диета, допълнена с гама-циклодекстрин. Групата на западна диета с прополис също показа статистически значимо намаляване на размера на новообразуванията в сравнение с групата на мишки на западен тип диета без добавки.

Хистопатологичната оценка на новообразуванията разкрива, че по-големите размери на мишки, хранени със западна диета, корелират с по-бърза прогресия; само новообразуванията при тези мишки проявяват фокална некроза. От друга страна, най-ниската честота на неопластична прогресия при мишки, хранени със западна диета, допълнена с гама-циклодекстрин, се доказва не само от най-малкия брой и най-малкия размер на неопластични лезии, но и от хистологичната оценка на тъканите. Това откритие съвпада с наблюдението на повишени нива на апоптотични маркери в чревните тъкани на мишки, хранени с западна диета с гама-циклодекстрин. В червата гама-циклодекстрин може да се ферментира до късоверижни мастни киселини, включително бутират 30, и когато се прилага инвитро, бутират индуцира апоптоза в клетки с мутации, активиращи сигнализирането на WNT/бета-катенин, като мутациите в Apc ген 10. Следователно, повишената апоптоза в чревните тъкани на мишки на диета, допълнена с циклодекстрин, може да се дължи на апоптотичните ефекти на бутирата.

По-бързата неопластична прогресия при затлъстели мишки, хранени със западна диета, може да се дължи на по-висока степен на мутация, увеличен брой стволови клетки и разделения на стволови клетки, повишени нива на адипокини, епигенетични промени и промени в чревната микробиота 35. Някои от тези възможности бяха разгледани чрез анализи на екзоме за секвениране на нормално тегло (контролирани диети, хранени) и затлъстели (западни диети) мишки. Въпреки че средният размер на неопластичните лезии при затлъстели мишки е по-голям от този при мишки с нормално тегло, броят и видът на гените, засегнати от мутации с умерено и силно въздействие, са по-ниски при затлъстелите мишки. Този резултат подкрепя констатациите ни, че в сравнение с пациентите с нормално тегло, раковите геноми на пациентите със затлъстяване с CC показват по-малко соматични мутации и съответно по-малък брой мутации в гените на водача 4. Анализите на секвенирането не разкриват постоянни разлики във вида на засегнатите гени. Това може да се дължи на факта, че неопластичното развитие в нашия експеримент беше ограничено до стадия на прекарцинома; като има предвид, че анализите на човешки екзоми са извършени върху данни от карцином на дебелото черво на етап III от TCGA. Въпреки това, наличието на множество мутации дори на ранния етап на аденом вече е потвърдено при хора 36, 37 .

Благодарности

Това проучване е финансирано от безвъзмездна финансова помощ от Manuka Health New Zealand Ltd и изследователски фондове на TCMC. Благодарим на д-р A. Suddes от Manuka Health New Zealand Ltd за предоставянето Прополис с Cyclopower за нашите проучвания и Виктор Мелъри за грижите за мишките.