Институт по фармакология, Факултет по медицина, Университет Луи Пастьор и

Институт по фармакология, Факултет по медицина, Университет Луи Пастьор и

Service d'Hypertension, des Maladies Vasculaires et Pharmacologie Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, 67085 Страсбург, Франция

Институт по фармакология, Факултет по медицина, Университет Луи Пастьор и

Институт по фармакология, Факултет по медицина, Университет Луи Пастьор и

Институт по фармакология, Факултет по медицина, Университет Луи Пастьор и

Service d'Hypertension, des Maladies Vasculaires et Pharmacologie Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, 67085 Страсбург, Франция

Резюме

ренин-ангиотензиновата система (RAS) играе критична роля в регулирането на бъбречната хемодинамика и тубулната транспортна функция. Няколко проучвания демонстрират, че в бъбреците нивата на ANG II в тъканите са значително по-високи от нивата на циркулиране (3, 6, 31). Ние (10) потвърдихме тези резултати в кората и мозъка на бъбреците на плъхове. Някои данни също така предполагат съществуването на диференциално регулиране на циркулиращите и бъбречните ангиотензини (2, 6,9).

Наличието на основните компоненти на RAS, позволяващи образуването на ангиотензин, ангиотензиноген (7, 16, 19), ренин (29, 33) и ангиотензин-конвертиращ ензим (ACE) (1, 17), е доказано в бъбреците. Следователно, интрареналните нива на ANG II могат да бъдат резултат от локален синтез. Трябва да се отбележи, че локализацията на тези компоненти в бъбреците се различава. Ангиотензиногенът и ренинът се намират главно в бъбречната кора, докато активността на АСЕ е пет пъти по-висока в бъбречната медула, отколкото в бъбречната кора (10). Тези данни предполагат различна функционалност на RAS в бъбречната кора и медулата.

Експериментален дизайн

Мъжките плъхове Wistar-Kyoto са получени от Iffa-Credo (l'Arbresle, Франция) и са настанени в нашата лаборатория 1 седмица преди началото на лечението. Използван е 12: 12-часов цикъл на тъмна светлина (светлини от 6:00 до 18:00). Животните имаха свободен достъп до чешмяна вода и консумираха диета от чау-чау (UAR, Epinay sur Orge, Франция). За експериментите с променен хранителен прием на сол, животните са хранени с ниско съдържание на сол (LS група, 0,025% NaCl; н = 8), нормална сол (NS група, 1% NaCl; н = 7), или с високо съдържание на сол (HS група, 8% NaCl; н = 7) диета за 21 дни. Различните солеви диети (UAR 212, UAR 210 и UAR 210+, съответно) и дестилирана питейна вода са налични ad libitum. Всички животни са били на възраст 10 седмици в деня на вземане на проби и са били лишени от храна, но не и от вода в нощта преди вземането на проби от плазма и тъкани. Тъй като анестезията предизвиква силно стимулиране на RAS, плъховете са убити чрез обезглавяване.

Вземане на проби от плазма и бъбреци

След обезглавяване, ~ 5 ml кръв от ствола бързо се събират в ледено студени епруветки, съдържащи 0,25 ml инхибитор коктейл [2,5 mM фенантролин, 3 mM EDTA, 0,1 mM пепстатин, 3 μM инхибитор на ренин от плъх Ac-His-Pro-Phe-Val -Sta-Leu-Phe-NH2 (Неосистема), 0,11 mM неомицин сулфат; крайни концентрации] за измерване на ANG I и ANG II, 1 ml се използва за плазмена ренинова активност (PRA) и плазмен ангиотензиноген (EDTA епруветка), а 1 ml се използва за ACE активност (литиева хепаринова епруветка). Кръвта веднага се центрофугира при 4 ° С в продължение на 10 минути при 2000 ж. Плазмените проби бяха замразени в течен азот и съхранявани при -80 ° C до анализ.

След обезглавяването бъбреците веднага се отстраняват и разделят на две. Всяка половина от десния бъбрек бързо се дисектира върху ледено студена плоча в кората и медулата. Внимателно се внимаваше да се режат фини ивици от външната кора и да се ограничи медулата до нейния вътрешен участък, за да се ограничи присъствието на юкстамедуларни гломерули. Половината от всяка тъканна проба се използва за измерване на ANG I и ANG II; те бяха претеглени и впоследствие хомогенизирани в ледено студен метанол (9). Хомогенатите се центрофугират при 4 ° С в продължение на 10 минути при 2000 ж, и супернатантите се изпаряват до сухо и се съхраняват при -80 ° С. Другата половина от всяка тъканна проба се използва за определяне на бъбречна RA и се хомогенизира във фосфатен буфер с 144 mM PMSF-10 mM фенилживачен ацетат (в етанол) и се центрофугира при 4 ° С в продължение на 20 минути при 5000 ж (6). Супернатантите се съхраняват при -20 ° С до анализ.

Всяка половина от левия бъбрек също се дисектира в кората и медулата и се претегля. Половината от всяка тъканна проба се използва за определяне на бъбречен ангиотензиноген и се хомогенизира във фосфатен буфер с 1,5 М амониев сулфат, 1,5 тМ пепстатин (в етанол) и 144 тМ PMSF-10 тМ фенилживачен ацетат (в етанол); хомогенатът се центрофугира при 4 ° С в продължение на 20 минути при 5000 ж, и супернатантата се декантира. За да се утаи ангиотензиноген, концентрацията на амониев сулфат се регулира на 2.5 М чрез добавяне на 4 М амониев сулфат и супернатантата се центрофугира както преди. Утайката от амониев сулфат се суспендира отново във вода и се съхранява при -20 ° C до анализ (6). Другата половина от всяка тъканна проба беше замразена в течен азот; след размразяване на кората и медулата се добавя Triton X-100 (0,3%) и тъканите се хомогенизират и центрофугират при 4 ° С в продължение на 20 минути при 11 500 ж след ултразвук. Супернатантите се разреждат в Triton X-100 за определяне на ACE активността и се съхраняват при -20 ° C до анализ.

Измерване на RAS компоненти

Плазма и бъбречен ангиотензиноген.

Плазменият ангиотензиноген се определя чрез инкубиране на разредена плазма с фосфатен буфер, пул от екзогенен ренин на плъх и 144 mM PMSF (в етанол) (6). След инкубация при 37 ° С в продължение на 60 минути, генерирането на ANG I се определя количествено чрез RIA, както е описано по-долу. Кортикалните и медуларните ангиотензиногенни проби се инкубират с фосфатен буфер, пул екзогенен ренин на плъх и 144 mM PMSF-10 mM фенилживачен ацетат (в етанол). След инкубация при 37 ° С в продължение на 120 минути се прибавят 0,5 ml 1% трифлуороцетна киселина; всяка инкубация се екстрахира с патрон Sep-Pak C18 (Oasis Waters, Milford, Ma), елуатът се изпарява до сухо и ANG I се определя от RIA (6). Плазмата и бъбречният ангиотензиноген се изразяват като нанограми на ANG I, генерирани на милилитър плазма и нанограми на ANG I, генерирани на грам тъканно тегло, съответно.

Действия на ренин на плазмата и бъбречната тъкан.

PRA се измерва чрез определяне на нивото на ANG I, генерирано по време на 30-минутна инкубация на плазма при 37 ° С в присъствието на 5 тМ 8-хидроксихинолин. ANG Бях измерван от RIA. В кората и медулата RA се измерва след определяне на ANG I, генериран по време на 30-минутна инкубация на разредени супернатанти в присъствието на плазма, обогатена с ангиотензиноген, получена от плъхове 48 часа след бинефректомия (6). ANG Бях измерван от RIA. PRA и бъбречната RA се изразяват като нанограми на ANG I, генерирани на милилитър плазма на час и микрограми на ANG I, генерирани на грам тъканно тегло на час, съответно.

Плазмени и бъбречни ACE дейности.

АСЕ активността се определя in vitro с ензимен метод. In vitro плазмените и бъбречните ACE активности се определят, както е описано от Unger et al. (35) в присъствието на изкуствен субстрат (10 mM н-карбобензокси-Phe-His-Leu, 67 тМ фосфатен буфер, рН 8,0, 300 тМ NaCl, 10 цМ ZnSO4). Полученият от реакцията дипептид (His-Leu) се измерва спектрофлуориметрично след свързване с o-фталдиалдехид. За да се осигури линейност на измерването на активността на АСЕ, концентрацията на протеин в анализа се поддържа на -1 · h -1;P

солта

Фиг. 1.Плазмени компоненти на ренин-ангиотензиновата система на плъхове, консумиращи ниско съдържание на натрий (LS; 0,025% NaCl; н = 8), нормален натрий (NS; 1% NaCl; н = 7) или високо натриев (HS; 8% NaCl;н = 7) диета за 21 дни. Стойностите са средни стойности ± SE. *P

Хранителната диета не променя значително плазмените нива на ангиотензиноген, нивата на ANG I и ANG II или съотношението ANG II към ANG I в сравнение с диетата NS (фиг. 1). Хранителната диета намалява PRA (6.16 ± 1.28 срещу 21.82 ± 1.21 ng ANG I · ml −1 · h −1;P -1 mg mg протеин -1; P −1 · h −1; P

Фиг. 2.Компоненти на ренин-ангиотензиновата система в бъбречната кора на плъхове, консумиращи LS (н = 8), NS (н = 7) или HS (н = 7) диета за 21 дни. Стойностите са средни стойности ± SE. *P

Хранителната диета не променя нивата на кортикален ангиотензиноген, RA, съотношението ANG II към ANG I или АСЕ активността в сравнение с диетата NS. Хранителната диета намалява ANG I (196,92 ± 22,26 срещу 317,53 ± 16,99 fmol/g тъкан; P −1 · h −1; P

Фиг. 3.Компоненти на ренин-ангиотензиновата система в бъбречния мозък на плъхове, консумиращи LS (н = 8), NS (н = 7) или HS (н = 7) диета за 21 дни. Стойностите са средни стойности ± SE. *P