Тарин Л. Кранфорд

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Канди Т. Веласкес

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Рейли Т. Енос

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Александър Т. Сугианис

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Джаки Е Бадер

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Мередит С. Карсън

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Ребека Р. Белоун

b Департамент по здравеопазване и възпроизводство на населението, Училище по ветеринарна медицина, Калифорнийски университет в Дейвис, Дейвис, Калифорния, САЩ

Юлия Чацистаму

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Мици Нагаркати

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

Д. Анджела Мърфи

катедра по патология, микробиология и имунология, Медицински факултет, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина, САЩ

РЕЗЮМЕ

Въведение

Редица механизми вероятно свързват затлъстяването с BrCA. Въпреки това възпалението може да е на преден план. Хроничното възпаление е признато за важен медиатор в клиничните и биохимични усложнения, свързани със затлъстяването, а също и биологията на тумора на гърдата и причинно-следствената връзка. Възпалението в мастната тъкан (AT), с инфилтрация от макрофаги, е добре установена характеристика на затлъстяването и неговото присъствие в гърдата създава местни условия, които благоприятстват трансформацията на епителните клетки на гърдата, пролиферацията и инвазията на ракови клетки, както и свързаната с тумора неоваскуларизация, които допринасят за лоша прогноза. Освен това се съобщава, че възпалението, медиирано от затлъстяване, стимулира синтеза на естроген, което увеличава риска от HP BrCA; предходни проучвания свързват повишаването на регулацията на AT-възпалителни цитокини с експресията на естроген синтазата цитохром Р450 (ароматаза) в проучвания с миши 24 и при BrCA 25, 26 преди и след менопаузата .

Резултати

PyMT и мишки от див тип, хранени с HFD, имат повишено наддаване на телесно тегло и по-голямо общо тегло на висцералната мастна тъкан, отколкото мишки, хранени с LFD

Лечението с HFD значително увеличава телесното тегло както за групите WT, така и за PyMT, започвайки от 8 седмици диетично лечение и остава повишено през 16-седмичния период на лечение (Фигура 1 (а)), P Фигура 1 (b), P Фигура 1 ( а)) и общото тегло на висцералната мастна тъкан (Фигура 1 (б)). Анализът на телесния състав на WT мишките на 16-та седмица от лечението показва, че мишките, хранени с HFD, имат значително по-голямо тегло на телесните мазнини в грамове и процент телесни мазнини (Фигура 1 (c), D, P Фигура 1 (e)).

индуцирано

Характеристики на телесното тегло за експеримент преди менопаузата. WT и PyMT мишките бяха хранени или с LFD, или с HFD в продължение на 16 седмици. Телесното тегло се проследява седмично за всички групи. Съставът на тялото за WT мишки беше оценен в края на проучването (на възраст 20 седмици); PyMT групите не са анализирани за телесен състав, тъй като туморите могат да променят изчисленията на чистата маса. Висцералните мастни накладки бяха отстранени и претеглени в края на 16-седмичното диетично лечение. а. Телесно тегло в грамове. б. Общо абсолютно тегло на висцералните подложки. ° С. Анализ на телесния състав на WT мишки, телесна мазнина в грамове. д. Процент телесни мазнини. Д. Чисто тегло в грамове. * основен ефект от диетата. Данните са представени като ± SEM, WT LFD, n = 8 WT HFD, n = 8 PyMT LFD, n = 12 PyMT HFD, n = 15.

Хроничната консумация на диета с HFD увеличава туморогенезата и прогресията на хистопатологичния туморен стадий при модел в пременопауза

Жертвен тумор и точкуване на хистопатология за експеримент преди менопаузата. WT и PyMT мишките бяха хранени или с LFD, или с HFD в продължение на 16 седмици. След 16-седмично диетично хранене мишките бяха евтаназирани и туморите бяха отстранени, измерени, преброени и претеглени. За да потвърдим, че диетата не влияе върху експресията на трансгена, ние измерихме експресията на иРНК на трансгена PyMT в млечната жлеза. Оценяването на хистопатологията на млечната жлеза се извършва след H&E оцветяване за групи, третирани с LFD и HFD. а. Пожертвайте обема на тумора на мишка. б. Пожертвайте туморния брой на мишка. ° С. Жертва туморна тежест (тегло) на мишка. д. експресия на иРНК на PyMT трансгена в млечната жлеза. д. Хистопатология на млечната жлеза и за двете групи на лечение. е. Представителни изображения от степен на дисплазия, използвани за идентифициране на всяка лекувана група. * P Фигура 3 (а), P Фигура 3 (b), P Фигура 3 (c), P # основен ефект на генотипа. Данните са представени като ± SEM, WT LFD, n = 8 WT HFD, n = 8 PyMT LFD, n = 12 PyMT HFD, n = 15.

Туморогенезата увеличава маркерите за възпаление и пролиферация в млечната жлеза

Няма разлика в експресията на иРНК на маркери на макрофаги (F4/80 и CD64) между групите с рак на LFD и HFD в млечната жлеза на PyMT мишки. HFD храненето обаче доведе до възходяща тенденция в експресията на макрофагния маркер Mer тирозин киназа (Mertk) в млечната жлеза (Фигура 3 (d), p = 0,06). Значителен основен ефект на генотипа се наблюдава в експресията на иРНК на възпалителни цитокинови и хемокинови маркери (IL-6, TNFα и MCP-1) и маркера за пролиферация Ki67 на млечната жлеза (Фигура 3 (д), Р Фигура 3 (е)).

Дългосрочното хранене с HFD драстично увеличава наддаването на телесно тегло за мишки с овариектомия, което води до значително увеличение на общото тегло на висцералните мазнини над мишки, хранени с LFD

Лечението с HFD значително (над 2 пъти) повишава телесното тегло за мишки с овариектомия, започвайки с първата седмица на диетично лечение и остава повишено през 18-седмичния период на лечение (Фигура 4 (а), Р Фигура 4 (б)) и общото тегло на гонадната мастна тъкан (2 пъти) (Фигура 4 (в)), като мишките, хранени с HFD, имат значително по-голямо общо тегло (P Фигура 5 (а)), номер на тумор (Фигура 5 (а)), нито тегло на тумора ( Фигура 5 (в)) между групите за диетично лечение в този модел. Всъщност само малък процент от мишките от всяка група, 25% и 20% за мишки, хранени с LFD и HFD от всяка група, съобщават за хистопатологично прогресиране на стадия на млечната жлеза в степен MIN или по-нататък (Фигура 5 (d)). По същия начин, лечението с HFD няма ефект върху възпалителните цитокини, IL-6 и TNFα, експресия в млечната жлеза (Фигура 5 (д)).

В обобщение съобщаваме, че индуцираното от HFD затлъстяване води до увеличаване на туморогенезата на млечната жлеза и експресията на надрегулирана ароматаза в AT на гонадите в миши модел на HP PyMT/MMTV на пременопаузален BrCA. Въпреки че експресията на ароматаза е замесена в модулирането на множество механизми в постменопаузалния BrCA, неговото участие в туморогенезата в модел на пременопауза не е установено. Въпреки че е добре известно, че затлъстяването води до повишени нива на възпалителни медиатори, са необходими допълнителни изследвания, за да се демонстрира функционалната връзка на повишената експресия на ароматазата в туморогенезата на млечната жлеза. Тази ос на затлъстяване, възпаление и ароматаза осигурява основата за разработване на базирани на механизми стратегии за намаляване на риска от HP BrCA в този нарастващ сегмент от населението.

Материали и методи

Животни

Мъжките мишки PyMT/MMTV на фон C57BL/6 бяха произволно отглеждани с женски мишки от див тип (WT) за получаване на женски мишки, хетерозиготни за PyMT трансгена. Бяха проведени два независими експеримента за изследване на туморогенезата на млечната жлеза, тъй като тя се отнася до менопаузалния статус. Първият експеримент (Exp1) използва интактни женски яйчници на PyMT и женски WT котила са включени като контрол без заболяване. Мишките в Exp1 бяха евтаназирани на 20-седмична възраст (16-седмично диетично лечение). Вторият експеримент (Exp2) включва само женски овариектомирани PyMT. На 5-седмична възраст мишките претърпяха операция на овариектомия и им беше позволено една седмица да се възстановят преди началото на диетичното лечение. Мишките в Exp2 бяха евтаназирани на 24-седмична възраст (18 седмици диетично лечение). Всички експериментални мишки бяха отглеждани и обгрижвани в съоръжението за изследвания на животни в Университета на Южна Каролина. Те бяха настанени, 3–5/клетка, поддържани в 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина в среда с ниско напрежение (22°C, 50% влажност, нисък шум) и дадена храна и вода ad libitum. Принципите на лабораторните грижи за животните бяха спазени и Институционалният комитет за грижи и употреба на животните към Университета на Южна Каролина одобри всички експерименти.

Протокол за генотипиране

Женски мишки бяха използвани във всички експерименти и бяха генотипизирани за PyMT трансгена, използвайки праймерните последователности, както следва:

Отрязък от опашка на мишка се добавя към 150ul буфер за опашка DirectPCR (Viagen Biotech Inc, Лос Анджелис, Калифорния) и 2ul протеиназа К (Viagen Biotech Inc, Лос Анджелис, Калифорния) и се усвоява при 55 ° С за една нощ. На следващия ден пробите се инкубират при 95 ° С за един час, след което се добавят към PCR коктейл за амплификация. PCR коктейлът съдържа ДНК шаблон, праймери нагоре и надолу по веригата, ddH20, и GoTaq Green Master Mix (Promega Corp, Madison, WI). Пробите бяха пуснати на 2% агарозен гел и сравнени с контролните проби за определяне на генотипа (520 базови двойки молекулно тегло за PyMT/MMTV положителни проби).

Овариектомия

Мишките бяха анестезирани за кратко с изофлуран. Гръбната средна лумбална област беше обръсната и намазана с йод и алкохол. 2-сантиметров гръбен разрез на средната линия на кожата е направен по средата между каудалния ръб на гръдния кош и основата на опашката. Фасцията е изчистена с помощта на тъпа дисекция. Направен е един разрез с дължина по-малка от 1 cm в мускулната стена от дясната и лявата страна приблизително 1 cm странично от гръбначния стълб. Яйцеклетката и маточните рога, разположени в мастната подложка под гръбния мускул, бяха извлечени през разрезите с форцепс. И двата маточни рога бяха завързани под яйчника с шев (непоглъщаем шев 5–0, котка # S-G518R13) и яйчниците бяха отстранени с единични разрези. Маточните рога бяха поставени обратно в перитонеалната кухина. Мускулните разрези бяха затворени с 5–0 абсорбиращ се шев (Cat # S-G518R13-U). За затваряне на разреза на кожата са използвани щипки за рани. Животните бяха изследвани за възстановяване на разреза или инфекция в продължение на най-малко 72 часа след операцията. Клипсовете за рани бяха отстранени в 7-дневен период след операцията.

Диети

За Exp1, PyMT мишките и WT мишките без контрол на болестта бяха разпределени на случаен принцип или на диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), или на група за лечение с HFD, започваща на 4-седмична възраст. Диетата AIN-76A (11,5% ккал като мазнина) се използва за LFD (Bioserv, Frenchtown, NJ) 45, 46. AIN-76A е пречистена, балансирана диета, която не съдържа фитоестроген. Доказано е, че диетичните фитоестрогени оказват влияние върху поведението, свързано с безпокойството, отлагането на мазнини, нивата на кръвен инсулин, лептин и щитовидната жлеза, както и липогенезата и липолизата в адипоцитите 47. Диетата D12492 (60% ккал като мазнина) се използва за HFD (Research Diets, New Brunswick, NJ). Мишките са хранени със съответните си диети в продължение на 16 седмици.

В Exp2, PyMT мишките на 6-седмична възраст бяха произволно разпределени към същите групи за лечение на LFD и HFD, използвани в експеримент 1. Мишките бяха хранени със съответните си диети в продължение на 18 седмици.

Телесно тегло, прием на храна и телесен състав

Тегленето на тялото и приемът на храна се наблюдават ежеседмично и за двата експеримента. Съставът на тялото за WT мишки беше оценен в края на проучването (на възраст 20 седмици) в Exp1. PyMT групите не са анализирани за телесен състав, тъй като туморите могат да променят изчисленията на чистата маса. Накратко, мишките бяха поставени под упойка (вдишване на изофлуран) и бяха оценени за чиста маса, мастна маса и процент телесни мазнини чрез рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия (DEXA) (Lunar PIXImus, Madison, WI) 46 .

Палпации на тумора

Туморите бяха измерени, започвайки на 14 седмична възраст (10 седмици диетично лечение) и 14 седмична възраст (8 седмици диетично лечение), за всеки от Exp1 и Exp2, съответно, от същия изследовател. Мишките PyMT/MMTV обикновено развиват осезаеми тумори на млечната жлеза между 12 и 16 седмична възраст на 27 години. При палпация на тумор са използвани апарати за измерване на най-дългия и най-къс диаметър на тумора. Броят на туморите във всяка мишка се записва и обемът на тумора се изчислява за всеки тумор, използвайки формулата: 0,52 X (най-голям диаметър) X (най-малък диаметър) 2, както е описано по-рано 48 .

Събиране на тъкани

След 16 седмици (Exp1) и 18 седмици (Exp2) на диетично лечение, мишките бяха умъртвени за събиране на тъкани. Видимите тумори се дисектират от млечните жлези и се измерват, за да се определи теглото на тумора и обема на тумора. След това част от останалата гръдна тъкан на млечната жлеза се отстранява както от дясната, така и от лявата страна. Висцералните мастни подложки бяха отстранени. Тези тъкани бяха или бързо замразени в течен азот за анализ на генната експресия, или фиксирани в 4% формалдехид за имунохистохимичен анализ.

Хистология

Част от гръдната млечна жлеза от Exp1 и Exp2 беше изрязана от всяка мишка, фиксирана за една нощ в 4% формалдехид, дехидратирана с алкохол и вградена във восък. Парафиновите срезове се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E). Впоследствие млечната жлеза беше оценена сляпо от патолог и характеризирана според степента на дисплазия: липса на хиперплазия, аденом/интраепителна неоплазия на млечната жлеза (MIN) и ранен и късен инвазивен карцином и за двата експеримента 27. Проведена е имунохистохимия за оцветяване на α-SMA (Cell Signaling # 19245), за да се потвърди степента на дисплазия. Освен това се наблюдава инфилтрация на моноцити/макрофаги чрез положително оцветяване на CD68 + (Cell signaling # 76437) клетки в млечната жлеза.

PCR почистване за секвениране на PyMTtransgene

Една gDNA проба и cDNA проба от всяка обработена група (PyMT Con 4 и PyMT HFD 2) бяха използвани за експерименти за секвениране на PyMT трансгена. gDNA и cDNA бяха включени, за да се потвърди, че трансгенната последователност не съдържа вмъкване на плазмид/вектор интрон. PCR почистването на проби се извършва с помощта на EdgeBio Quick Step 2 PCR комплект за пречистване, следвайки производствения протокол (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD). Елуатите се задържат за секвениране.

Последователност на PyMT трансгена

За трите проби бяха проведени две реакции на секвениране на Sanger (по една за всеки праймер), като се използва Big Dye chemistry (Applied Biosystems, Foster City, CA), следвайки препоръките на производителя, освен ако не е посочено друго. По-конкретно, всяка 20 µL реакция съдържа 1ul от Big Dye версия 3.1, 0.5ul от праймера (10 mM от PYVT1 или PYVT2) и 5ul от PCR почистен продукт. PCR за прекратяване на веригата се извършва в продължение на 50 цикъла. Продуктите бяха пречистени от излишните праймери и dNTPS с помощта на Edge Bio Performa Gel Filtration Cartridge (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) и открити с помощта на Applied Biosystem 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Последователностите бяха визуализирани и сглобени с помощта на Sequencher Версия 5.2.4 (http://www.genecodes.com).

Количествена PCR в реално време

Статистически анализ

Всички данни бяха анализирани с помощта на търговски софтуер (GraphPad Software, Prism 7, La Jolla, CA, USA). За Exp1, общото телесно тегло се анализира, като се използва двупосочен дисперсионен анализ във всяка точка от времето. Общото тегло на висцералните мазнини, общото тегло на мастните жлези, mRNA анализът на мастните жлези F4/80, медиаторите на възпалението на млечните жлези и пролиферацията и VEGFα бяха анализирани с помощта на двупосочен дисперсионен анализ. Цялата информация за DEXA, данни за жертва на тумор, тРНК анализ на мастна жлеза CD11c, CD64, Cy19A1, мРНК анализ на млечна жлеза на MMP2/9 бяха анализирани с помощта на двустранен t-тест. Корекцията на Bonferroni се използва за всички post-hoc анализи. В Exp2 всички данни бяха анализирани с помощта на двустранен t-тест. Статистическата значимост е определена със стойност α от P ≤ 0,05. Данните са представени като средна стойност ± SEM.

Отчет за финансиране

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Националните здравни институти (F31CA183458 за T.L.C. и R21CA167058, R21CA175636, R21CA191966 и K01AT007824 за E.A.M.)

Разкриване на потенциален конфликт на интереси

Не са разкрити потенциални конфликти на интереси.