Резюме

Диета-индуцираното затлъстяване (DIO) е водеща здравна грижа за населението на света, в светлината на ефектите върху разходите за здравеопазване, заболеваемостта и смъртността. 1,4,28 Въпреки че режимът, който съчетава ограничаване на калориите с упражнения, изглежда най-ефективното лечение за DIO, изследванията 16-18 не са напълно дефинирали кои аспекти на упражненията са най-важни. Моделите на мишки за лечение на DIO представляват отлична възможност за тестване на различни видове упражнения, които могат да се използват за лечение на хора.

В допълнение към загубата на тегло е доказано, че упражненията предизвикват противовъзпалителни свойства, които могат да бъдат измерени като промени в концентрацията на моноцити в кръвта и експресията на функционалните рецептори. 8,15,17 По-рано установихме, че принудителната бягаща пътека, работеща по време на DIO, не е предотвратила наддаване на тегло или промени в кръвните моноцити. 8 Други спекулират, че принудителните упражнения при мишки са ефективен начин на лечение поради ненужен психологически стрес, като по този начин предотвратяват противовъзпалителните ефекти, които обикновено са свързани с тренировките за упражнения. 2

Въпреки че има много начини за оценка на вродения имунен статус, нашата лаборатория и други са се фокусирали върху концентрацията на моноцити и експресията на функционални рецептори. 8,15,17 Нашата лаборатория е проследила пътя на Toll-like receptor (TLR) като средство за проследяване на промените в системния възпалителен капацитет. 17-19 Пътят на TLR се счита за ключов медиатор на вродения имунен отговор 14 и системното възпаление. 10,17 Субекти, хранещи се с високо съдържание на мазнини, показват повишена генна експресия на TLR2 и TLR4 върху кръвни моноцити с повишаване на кръвните мастни киселини и хипергликемия. 22,26 Експресията на TLR4 и TLR2 на клетъчната повърхност in vitro върху кръвни моноцити се увеличава в отговор на повишената концентрация на глюкоза в кръвта. 5 Повишените глюкоза на гладно и високите нива на холестерол, които често се появяват по време на наддаване на тегло, са известни рискови фактори за няколко заболявания, свързани със затлъстяването; следователно увеличаването на TLR4 и TLR2 се смята за част от възпалителния процес, който води до заболяване.

Освен това е доказано, че TLR4 влияе върху състава на тялото при мишки. TLR4-нокаутираните мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, получават по-малко телесни мазнини, отколкото мишки от див тип. 12 В друго проучване 26 нокаутиращи мишки TLR4 тежат средно с 15% по-малко, отколкото контролите от див тип след 8-седмично хранене с високо съдържание на мазнини. В допълнение, адипоцитите са с 30% по-малки при нокаутиращите мишки TLR4, което показва, че липсата на TLR4 засяга натрупването на мазнини. 26 Освен това, TLR4-нокаутиращите мишки са намалили експресията на проинфламаторните цитокини IL6 и TNFα, 26 в съответствие с други проучвания, които съобщават за намаляване на възпалителния статус на мишки, които нямат TLR4. 14,24 Разглеждането на тези резултати заедно ни доведе до хипотезата, че TLR може да играе роля в наддаването на тегло и възпалителния статус, което води до прогресиране на заболяването.

Костимулиращите молекули CD80 и CD86 също са известни като част от възпалителния процес. Както CD80, така и CD86 присъстват в антиген представящите клетки и взаимодействат с Т клетките, за да ги подготвят срещу антигенна атака. 21 Доказано е, че тези молекули се увеличават с възпалителни състояния като сърдечно-съдови заболявания и затлъстяване 7 и могат да намалят след противовъзпалителен процес като упражнения. 15

Тук оценихме загуба на тегло при DIO мишки, лекувани в продължение на 8 седмици с доброволно сравнение с принудително упражнение. Също така оценихме ефектите от тези режими върху концентрацията на моноцити в кръвта и експресията на TLR2, TLR4, CD80 и CD86. Ние предположихме, че при мишки, които са затлъстели след консумация на диета с високо съдържание на мазнини, доброволното упражнение, комбинирано с диета с ниско съдържание на мазнини, ще доведе до по-големи промени в възпалението, отколкото диетата с ниско съдържание на мазнини, самостоятелно или в комбинация с принудителни упражнения.

Материали и методи

Животни.

Всички процедури, описани в този доклад, бяха прегледани и одобрени от университета в Хюстън IACUC (Хюстън, Тексас). CD1 мъжки мишки са закупени от Charles River Laboratories (Wilmington, MA), татуирани (AIMS Tattoo System, Binghampton, NY) на опашката за целите на идентификацията и държани на обратен 12: 12-часов светлинен: тъмен цикъл (светлините изключени, 1000). Мишките бяха на възраст от 12 до 14 седмици в началото на фазата на наддаване на тегло и 64 до 66 седмици в началото на етапа на активна намеса. Мишките бяха настанени индивидуално в стандартна микроизолационна клетка (Tecniplast, Exton, PA) по време на проучването. Телесното тегло и консумацията на храна се измерват ежеседмично с помощта на цифрова скала (MyWeigh, Phoenix, AZ). На мишките се подаваше храна върху капаци от телена клетка. Два пъти всяка седмица храната се сменя и остатъчните (оставената храна в капака на клетката) и похабените (храна в дъното на клетката) се комбинират и претеглят. Консумираната храна се определя чрез изваждане на остатъчна или похабена храна от общото количество дадена храна.

Определяне на размера на пробата.

Размерът на извадката от 24 за това настоящо проучване е избран въз основа на априорно изчисление на размера на извадката, което използва променливата на резултата с най-малък размер на ефекта (в този случай, експресия на моноцитен TLR4). 8 Това изчисление показва, че ако се използва модел на повтарящи се мерки, са ни необходими минимум 5 мишки на група за лечение, за да се открият статистически значими разлики между 3-те групи за лечение с DIO.

DIO при мишки.

DIO е създаден при мишки CD1 чрез използване на протокол за наддаване на тегло, разработен в нашата лаборатория и документиран другаде. 3 Накратко, за да предизвикат DIO, на мишките беше осигурен ad libitum достъп до високомаслена, висококалорична диета (5,24 kcal/g: 60% от мазнини, 20% от протеини и 20% от въглехидрати) за 12 месеца; CN мишките получиха либитум достъп до нискомаслена, нискокалорична диета (3,85 kcal/g; 10% от мазнини, 20% от протеини и 70% от въглехидрати) за 12 месеца. И двете диети са закупени от Research Diets (New Brunswick, NJ). Източникът на мазнини и при двете диети беше соево масло и свинска мас (съдържание на холестерол, 0,95 mg/g). Всички групи имаха свободен достъп до вода.

Групово задание.

След 12-месечната фаза на DIO, всяка мишка беше разпределена произволно към 1 от 3 групи за лечение (n = 6 на група) според състава на диетата и упражненията: доброволно упражнение (VEX), упражнение с принудителна бягаща пътека (FEX) и заседнало ( С). След разпределението мишките от 3-те лечебни групи започнаха да консумират диета с ниско съдържание на мазнини, на която останаха CN мишки. S и CN мишките бяха ограничени до нормална ежедневна активност в клетките си; тези мишки са били заседнали в смисъл, че не са се подлагали на структурирана физическа активност. Телесното тегло и приема на храна се измерват ежеседмично с помощта на цифрова скала. На всички групи беше осигурен свободен достъп до храна и вода по време на фазата на отслабване.

Принудително упражнение.

В групата FEX мишките тичаха на моторизирана бягаща пътека (Columbus Instruments, Columbus, OH) 5 дни всяка седмица (от понеделник до петък). Всяка тренировъчна сесия се състоеше от 60 минути бягане на бягаща пътека (22 м/мин) през първите 2 часа от тъмния цикъл (1000 до 1200). Бягащите пътеки са били успешни като средство за аеробна намеса в изследванията на мишките, тъй като мишките ще работят с малко или никаква мотивация. 8,20 Ако мишките не са искали да бягат, те са били натискани внимателно с ръка, за да ги насърчават.

Доброволно упражнение.

Мишките от групата VEX бяха настанени индивидуално в предлаганите на пазара колела (Tecniplast) с 24-часов достъп до упражняващо колело 5 d всяка седмица (от понеделник до петък), за да съответстват на дните, в които FEX групата работи. Упражняващото колело (обиколка, 73 см) е свързано с компютър, който записва времето на деня и броя завъртания на колелата, извършени от отделни мишки. От тези данни изчислихме изминатото разстояние всеки ден.

Нелетално вземане на кръв.

Взимането на кръв е завършено на изходно ниво, седмица 4 и седмица 8 от изследването, като се използва нелетална техника. 8 Накратко, през последните 2 часа от светлинния цикъл (0700 до 0900) и след една нощ (поне 8 часа) на гладно и въздържане (повече от 48 часа) от упражнения, мишките бяха поставени в модифицирана 50-милилитрова епруветка за центрофуга с задните им крайници достъпни. Задният крайник беше обръснат с електрически ножици, тънък слой вазелин беше нанесен върху кожата и сафенозната вена беше пробита с помощта на 5-милиметров стерилен ланцет (Medipoint, Mineola, NY). Приблизително 60 µL кръв бяха събрани в подходящо етикетирана капилярна тръба, обработена с литий-хепарин, с микровети (Sarstedt, Nümbrecht, Германия).

Оцветяване и придобиване с поточна цитометрия.

Двуцветна поточна цитометрия се използва за анализ на концентрацията на моноцити и експресията на клетъчната повърхност на TLR2, TLR4, CD80 и CD86, както е описано по-горе. 3 Всички антитела и разтвори са закупени от един и същ доставчик (eBioscience, Сан Диего, Калифорния), освен ако не е посочено друго. Накратко, аликвотна част от цяла кръв (5 uL) се комбинира с блокиращ FC рецептора коктейл (разреждане 1:50 на немаркиран антиCD16/32), за да се сведе до минимум неспецифичното свързване. Към всяка кръвна проба се добавя двуцветен коктейл от антитела (маркиран с PECy5 CD14 и PE-маркиран TLR2, TLR4, CD80 или CD86) и се инкубира за 30 минути на тъмно при стайна температура. Използвана е изотипна контролна епруветка за идентифициране на отрицателна популация. Напреженията на PMT бяха определени чрез използване на контролите на изотипа, за да се гарантира, че отрицателните популации са в рамките на първото логаритмично десетилетие за всички цветове. Еритроцитите се лизират с търговски лизиращ буфер и се измиват преди окончателна суспензия в оцветяващ буфер (100 μL) и 1% разтвор на параформалдехид (100 μL; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Сигнали бяха получени в рамките на 48 часа след фиксирането върху поточен цитометър (Guava EasyCyte Mini, Millipore, Billerica, MA), оборудван с 20 mW, 488 nm твърдо лазер. Некомпенсираните файлове с данни FCS 2.0 бяха експортирани за допълнителен анализ.

Анализ на поточната цитометрия.

Придобитите файлове с данни на FCS бяха електронно компенсирани за спектрално припокриване и анализирани офлайн с помощта на FCS Express (версия 3, De Novo Software, Лос Анджелис, Калифорния). Моноцитите са идентифицирани и количествено определени чрез използване на страничен разсейвател (SSC) в сравнение с CD14 точков график. Експресията на клетъчна повърхност на TLR2, TLR4, CD80 или CD86 като средна геометрична интензивност на флуоресценция се определя количествено чрез използване на индивидуални хистограми, затворени при събития CD14 +. В раздела Резултати са използвани проценти за илюстриране на промените, но данните не са анализирани като процентна промяна.

Статистически анализ.

Всички статистически анализи бяха завършени с използване на SPSS версия 17.0 (SPSS, Чикаго, IL). Данните бяха изследвани преди официален анализ, за ​​да се оцени тяхното нормално разпределение. Ненормалните данни бяха преобразувани в дневник преди анализ. Теглото на тялото, приемът на храна и пробегът от разстояние бяха анализирани чрез използване на ANOVA 4 (група) × 8 (време) с повторни измервания на втория фактор. Измерванията на моноцитите бяха анализирани чрез използване на 4 (група) × 3 (време) ANOVA с повторни измервания върху втория фактор. Статистическата значимост е определена при Р стойност по-малка от 0,05. Местоположението на значителни разлики беше завършено с помощта на Tukey post hoc тест. Данните бяха представени като или средна стойност на групата ± 1 SD или процентна промяна спрямо изходното ниво, в зависимост от естеството на измерването на резултата.

Резултати

Телесно тегло.

DIO мишките са спечелили средно 53% от първоначалното телесно тегло, в сравнение със средно 35% за CN, като по този начин телесното тегло на изходно ниво е с 28% по-ниско при CN при FEX, VEX и S мишки (F24,144 = 16,024 P Фигура 1). Този ефект се дължи на 12-месечната фаза на предварителна обработка, когато CN мишките консумират диета с ниско съдържание на мазнини, но групите FEX, VEX и S консумират диета с високо съдържание на мазнини. Телесното тегло намалява всяка седмица по време на фазата на отслабване, което води до значителен ефект във времето (F8,144 = 190,414, P Фигура 2). На 8 седмица VEX имаше 60% до 78% по-малко експресия на TLR2, отколкото останалите 3 групи. Подобно значимо взаимодействие между група × време (F6,36 = 3.394, P = 0.009) беше намерено за експресия на TLR4 на клетъчната повърхност. На 8-та седмица експресията на TLR4 във VEX е 130% по-ниска, отколкото в CN и 88% по-ниска, отколкото в FEX. В допълнение, значимо (F3,18 = 8.189, P = 0.001) групово взаимодействие е налице за експресия на TLR4 в изходното ниво. Експресията на TLR4 в CN е с 20% по-висока в сравнение с VEX и 47% по-висока в сравнение с S в изходното ниво.

ефекти

Експресия на клетъчна повърхност (средна геометрична интензивност на флуоресценция, gMFI) на (A) TLR2 и (B) TLR4 в моноцити. *, Значителен основен ефект за времето; #, значителна група × време взаимодействие; +, значителни групови ефекти от CN. Значимост, дефинирана като стойност P от 0,05 или по-малко.

CD80 и CD86 израз.

Значителен (F2,34 = 30,832, P Фигура 3); т.е. експресията на изходно ниво е значително по-различна от тази на седмица 4, а експресията на седмица 4 е значително по-различна от тази на седмица 8. Освен това, значителна (F2,34 = 11,599, P 5,22 Подобни увеличения на TLR2 и TLR4 експресия се наблюдава при мишки, които са отслабнали, но не са тренирали, което предполага, че принудителното бягане на бягаща пътека не е ефективно лечение за отслабване при мишки. Не сме наблюдавали специфични за лечението подобрения в експресията на моноцитни CD80 или CD86, което предполага, че независимо от режима, упражненията не задължително подобряват тези изходни мерки. Необходими са повече изследвания, за да се определи дали наблюдаваните промени в моноцитите са строго функция на настъпилата диференциална загуба на тегло. Контролирането на разликите в загубата на тегло статистически не отчита напълно техните биологични и имунологични последици.

В допълнение към свързаните с лечението разлики в загубата на тегло, ние отбелязахме различни реакции при моноцитите. Лечението с VEX води до по-голямо намаляване на експресията на моноцитни TLR2 и TLR4, отколкото лечението с FEX или S. Всъщност принудителните упражнения всъщност предизвикват леко увеличение на експресията на клетъчната повърхност на тези маркери, въпреки че увеличението е по-слабо изразено от това в S групата. Освен това тези промени могат да се отдадат на величината на енергийните разходи, която е най-голяма по време на доброволно упражнение, последвано от принудително упражнение и най-малко по време на заседнала активност. В светлината на предишни проучвания диференциалната способност на тренировъчното упражнение да отслаби повишената експресия на TLR2 и TLR4 вероятно се дължи на обема на тренировката (т.е. разстоянието на седмица). В друго проучване, 8 принудителни упражнения, подобни по обем на това на лечението с FEX в настоящото проучване по време на диета, индуцирано увеличаване на теглото, притъпява повишаване на експресията на моноцити TLR4, което предполага, че принудителните упражнения са достатъчни, за да се противопоставят на промените, свързани с диета качване на тегло. В настоящото проучване обаче е необходим увеличен обем на упражненията (както се наблюдава при доброволни упражнения), за да се противодейства на краткосрочните нарушения на загубата на тегло.

Предишна литература показва, че повишаването на TLR2 съпътства повишаването на триглицеридите и кръвната глюкоза, които са често срещани при заседналите пациенти, хранещи се с високо съдържание на мазнини. 5 Въпреки че при мишки от група S се наблюдава загуба на тегло, може би продължителният период на хранене с високо съдържание на мазнини е твърде дълъг, за да постигнат характеристиките на контролите с ниско съдържание на мазнини. Промените в загубата на тегло и възпалителния статус, които отбелязахме при мишки, са в съответствие с констатациите от хора след тренировка. 10 Тъй като нито настоящото проучване, нито други публикувани проучвания съвпадат с групи за принудителни и доброволни упражнения по обем на тренировката, ние не сме сигурни дали обемът или начинът на упражняване всъщност са причинили разликите, които открихме. Бъдещите изследвания трябва да сравняват принудителните и доброволните упражнения при еднакви обеми упражнения, за да се определи основният механизъм.

Резултатите от настоящото проучване добавят още един фактор, подкрепящ идеята, че упражненията, по-специално доброволните упражнения, могат да отслабят възпалителните маркери при мишки. Въпреки че предишно проучване 2 измерва възпалителни маркери в мастната тъкан (TNFα, MCP1 и т.н.), ние отбелязваме намаляване на експресията на моноцитни рецептори, което може да е показателно за възпалителен потенциал; тези клетки мигрират към периферните тъкани и узряват в резидентни макрофаги. В предишно проучване 11 16 седмици доброволно упражнение в диапазон, подобен на този в настоящото проучване, е свързано с намаляване на плазмения TNFα, резултат, който съответства на противовъзпалителното действие на упражнението. Увеличението на възпалителните маркери в кръвта вероятно се превръща и в провоспалително състояние в тъканите. 27 Намалена експресия на TNFα mRNA с хронично (12 до 20 m/min за 60 min/d на 5 d/wk за 16 wk) упражнение при мишки. 13 При хората само 9 седмици тренировки са свързани с намаляване на системното възпаление, както и с намалена експресия на моноцити на TLR2 и TLR4. 9,23,25 Следователно противовъзпалителният ефект в настоящото проучване е в съответствие с предишни доклади, включващи мишки и хора.

В заключение, разликите между доброволни и принудителни упражнения при мишки най-вероятно могат да се отдадат на разликите в обема на тренировката, като се има предвид, че VEX мишките са тренирали повече, отколкото FEX мишките. От приложна гледна точка, настоящото проучване демонстрира значението на упражненията за смекчаване на преходните смущения в моноцитите, които могат да възникнат по време на лечението на DIO. Необходими са повече изследвания, за да се разберат фините разлики между принудителните и доброволните режими на упражнения, но настоящото проучване предоставя критични данни, показващи, че упражненията по време на отслабване са полезни, намалявайки възпалителните биомаркери, независимо от режима. Нашите настоящи открития, както и бъдещите проучвания вероятно ще дадат допълнителна информация относно подобреното лечение на затлъстяването.

Благодарности

Това проучване беше финансирано отчасти от награда за изследване на развитието на студентите от Тексаската глава на Американския колеж по спортна медицина, награда за изследователска работа на студенти от Университета в Хюстън и лятна награда за стипендии от Тексаския център за изследване на затлъстяването към KCC. Авторите не декларират конфликт на интереси.