Връзка със затлъстяването, инсулиновата резистентност и експресията на фактор на туморна некроза-α

  1. Филип А. Керн,
  2. Джина Б. Ди Грегорио,
  3. Тонг Лу,
  4. Нега Расули и
  5. Гури Ранганатан
  1. 1 Здравна система на ветераните в Централен Арканзас и Медицинският департамент, Отдел по ендокринология, Университет на Арканзас за медицински науки, Литъл Рок, Арканзас
  1. Адресирайте кореспонденцията и заявките за повторно отпечатване до Филип А. Керн, заместник-началник на персонала, научни изследвания, здравна система за ветераните в Централна Арканзас, 598/151 LR, 4300 West 7th St., Little Rock, AR 72205. E-mail: kernphilipauams.edu

Връзка със затлъстяването, инсулиновата резистентност и експресията на фактора на туморната некроза-α

Резюме

Адипонектинът е 29-kDa адипоцитен протеин, който е свързан с инсулиновата резистентност при затлъстяване и липодистрофия. За да се разбере по-добре регулирането на експресията на адипонектин, ние измерихме нивата на мРНК на адипонектин в мастна тъкан и адипонектин в мастна тъкан при недиабетни пациенти с различна степен на затлъстяване и инсулинова резистентност. Плазмените нива на адипонектин и адипонектин иРНК са силно корелирани помежду си (r = 0,80, P 2 са сравнени, жените имат два пъти по-висок процент телесни мазнини, но техните плазмени нива на адипонектин са 65% по-високи (8,6 ± 1,1 и 14,2 ± 1,6 μg/ml при мъже и жени, съответно; P 126 mg/dl, 2-ч глюкоза> 200 mg/dl) са изключени. От 62 субекти 15 са имали нарушен глюкозен толеранс въз основа на 2-часов глюкозен тест от 140-200 mg/dl, а 4 от тези субекти са имали нарушена глюкоза на гладно на базата на глюкоза на гладно от 110–126 mg/dl. След това субектите са били подложени на често вземан тест за интравенозен глюкозен толеранс (FSIVGT) и биопсия на мастната тъкан, които са били извършвани в отделни дни.

диабет

Характеристиките на изследваните субекти са показани в Таблица 1. Липидите в кръвта, глюкозата и HbA1c бяха измерени с помощта на стандартни клинични тестове. От 62 изследвани субекта 50 са жени и 12 са афроамериканци. Субектите варират от слаби до много затлъстели (ИТМ в диапазона 19–65 kg/m 2). Някои пациенти демонстрират умерена дислипидемия, но никой не демонстрира триглицериди на гладно> 400 mg/dl. Съставът на тялото се определя с помощта на биоелектричен импеданс (18).

Измервания на инсулиновата чувствителност.

Измерването на in vivo инсулиновата чувствителност се извършва на гладно, като се използва класическият модифициран от толбутамид минимален моделен анализ на FSIVGT (19,20), който е валидиран спрямо евгликемичната скоба (21,22). Четири проби от базална кръв бяха получени на момент 0. След това пациентите получиха интравенозен глюкозен болус (11,4 g/m 2) и 20 минути по-късно инжекция с толбутамид (125 mg/m 2). След това се извършва често вземане на кръвни проби съгласно стандартния протокол. Глюкозата се измерва с помощта на метода на глюкозната оксидаза в глюкозен анализатор, а инсулинът се измерва с радиоимуноанализ (RIA; Ендокринологична лаборатория към Университетското училище в Индиана, Индианаполис, IN). Индексът на инсулинова чувствителност (SI) беше изчислен с помощта на програмата MINMOD, заедно с острия инсулинов отговор на глюкоза (остър инсулинов отговор на глюкоза [AIRglu]) (20).

Биопсия на мастната тъкан.

Коремна подкожна мастна тъкан (~ 5 g) се отстранява от всеки пациент чрез разрез. Част от тъканта незабавно се замразява в течен N2 за по-късно екстракция на РНК, докато останалата тъкан се поставя в студена модифицирана среда на Dulbecco's Eagle’s (DMEM) за други анализи. За измерване на секрецията на адипонектин и TNF-α, 500 mg мастна тъкан се смилат и се поставят в безсерумен DMEM (рН 7,4, 10 mmol/l HEPES) при 37 ° за различно време, както е описано по-рано (23). За да сравним секрецията на цитокини между различните субекти, измерихме нивата на цитокините в средата след 2 часа при 37 °. Всички данни бяха нормализирани или към съдържанието на мастна ДНК (24), или към броя на клетките, за да се контролират разликите в размера на мастните клетки. Броят на клетките беше измерен, използвайки метода на DiGirolamo et al. (25).

Измерване на експресията на цитокини.

За измерването на адипонектиновия протеин се използва радиоимуноанализ (Linco Research, St. Charles, MO). Този анализ демонстрира 4,3% вариация в рамките на анализа и 7,1% вариация в анализа. Този метод за анализ се използва за измерване на адипонектин в плазмата на гладно, както и секреция от мастна тъкан, както е описано по-горе. Нивата на адипонектин иРНК бяха измерени чрез Northern blotting с помощта на cDNA към човешки адипонектин и същите петна бяха повторно изследвани с cDNA до 18S РНК като конститутивна сонда (фиг. 1В). За количествено определяне на експресията на адипонектин иРНК, петна се анализират чрез денситометрия и съотношението адипонектин/18S РНК се дава като произволни единици.

Експресия на TNF-α.

Нивата на TNF-α mRNA бяха измерени, както е описано по-рано, като се използва конкурентна RT-PCR (26). Накратко, 0,4 μg обща РНК от мастна тъкан бяха добавени към нарастващи количества от конкурентна РНК конструкция, съдържаща вътрешна 49-nt делеция. След RT и PCR реакциите, продуктите се разтварят в 2% агарозен гел и гелът, оцветен с етидиев бромид, се определя количествено. Данните са изразени като „брой копия“ на микрограм обща РНК, където „брой копия“ се отнася до броя копия на сРНК, добавени в точката на еквивалентност между TNF-α mRNA продукт и cRNA. TNF-α и IL-6 протеинът бяха измерени с помощта на ензимно-свързани имуносорбентни анализи (R&D Systems, Minneapolis, MN), а лептинът беше измерен с помощта на RIA (Linco Research).

Статистика.

Всички данни са изразени като средни стойности ± SE. Анализът на тенденциите беше извършен с помощта на линейна регресия. При сравняване на две групи беше използван тест на Student за t и за анализ на данни между групи от три или повече, беше извършен еднопосочен ANOVA и беше извършен вторичен анализ с Student's t тест с корекция на Bonferroni.

РЕЗУЛТАТИ

Експресия на адипонектин и връзка със затлъстяването.

Връзката между адипонектин и инсулинова резистентност е по-силна от връзката със затлъстяването и не се наблюдават различия между половете. В допълнение, връзката между адипонектин и инсулинова чувствителност е независима от затлъстяването, както се демонстрира от съвпадението на субекти, които са били съгласувани по възраст и ИТМ, но несъответстващи на SI. За разлика от тях, лептинът не се различава в тези групи. В предишно проучване демонстрирахме, че секрецията на TNF и плазменият IL-6 също са свързани с инсулинова резистентност, независимо от затлъстяването (23). По този начин тези данни предполагат, че мастната тъкан експресира редица цитокини, които заедно са силно свързани с периферната чувствителност към инсулин.

Въпреки че нивата на адипонектин бяха значително свързани със SI, ние не намерихме доказателства за връзка между нивата на адипонектин и секрецията на инсулин. Това представлява интерес поради потенциалните връзки между съдържанието на липиди в островчетата и секрецията на инсулин. Троглитазон и други активирани от пероксизомен пролифератор рецептор-γ агонисти увеличават нивата на адипонектин (35–37), понижават съдържанието на липиди в островчетата и подобряват функцията на β-клетките при диабетни плъхове на Zucker (41). Тъй като адипонектинът е свързан с намалено липидно натрупване в тъканите (13), възможно е адипонектинът също да намалява съдържанието на липиди в островчетата, което води до повишена секреция на инсулин или подобрен отговор на β-клетките към инсулинова резистентност. Въпреки че тези проучвания не тестват напълно тази концепция, не можем да намерим доказателства за подобрена компенсация на β-клетките при пациенти с високи нива на адипонектин.

Няколко реплики показват, че свръхпроизводството на TNF-α от мастната тъкан може да бъде свързано с инсулинова резистентност, свързана със затлъстяването. TNF се експресира при по-високи нива в адипоцитите на затлъстели гризачи и хора (26,42,43), а нокаутиращите мишки на TNF не стават резистентни към инсулин при индуцирано от диетата затлъстяване (44). В допълнение, вливането на разтворим TNF-свързващ протеин в резистентни към инсулин плъхове fa/fa подобрява инсулиновата чувствителност и подобрява дефекта в автофосфорилирането на инсулиновия рецептор (42,45). Неотдавнашно проучване описва връзката между адипонектин и TNF-α при нокаут мишки с адипонектин (16). Въпреки че нокаутиращите мишки с адипонектин демонстрират нормална кръвна глюкоза и инсулин в основното състояние, те стават силно инсулиноустойчиви, когато се хранят с диета с високо съдържание на мазнини. Експресията на TNF е по-висока при адипонектиновите нокаутиращи мишки и прилагането на адипонектин при тези мишки води до подобряване на инсулиновата резистентност заедно с намаляване на експресията на TNF. По този начин, тези проучвания върху мишки предполагат, че TNF-α и адипонектин могат да бъдат антагонисти един на друг или че единият цитокин може да контролира експресията на другия.